STAT4正向调控抗病毒天然免疫反应及其作用机制研究

摘要

RIG-Ⅰ(Retinoid acid-inducible geneⅠ)样受体(RLRs)，是机体重要的识别RNA病毒的天然识别受体，包括RIG-Ⅰ和MDA5。其在识别RNA病毒的核酸之后，可通过形成信号转导复合物启动细胞内信号转导，促进Ⅰ型干扰素以及炎症细胞因子产生，从而发挥抗病毒效应。因此，RLR信号通路的有效调控一直是抗病毒天然免疫应答研究的热点。作为RLR信号通路的启动者，RIG-Ⅰ已经有大量的研究并揭示了其在RNA病毒感染时表达调控或者其信号转导的分子机制。
　　研究发现在抗病毒天然免疫应答中，STAT(The signal transducer and activator of transcription)家族分子STAT4可以促进RIG-Ⅰ诱导的IFN-β产生。当RNA病毒VSV或者SeV感染巨噬细胞时，干扰STAT4会抑制IFN-β以及炎症细胞因子IL-6和TNFα的产生，而当DNA病毒HSV-1感染巨噬细胞或者利用LPS、poly(I:C)刺激巨噬细胞时，则没有观察到此效应。进一步实验发现，过表达STAT4可以在RIG-Ⅰ层面增强IFN-β启动子、Ⅰ型干扰素应答元件ISRE(IFN-stimulated response element)启动子以及NF-κB启动子报告基因的活性。同时信号通路结果也证实干扰STAT4可以促进RIG-Ⅰ的降解。STAT4作为转录因子，通常可被磷酸化激活，并发生核转位，促进相关基因转录，Tyr693磷酸化是STAT4典型激活及核转位的必要条件。的结果发现，在RNA病毒感染巨噬细胞的过程中，STAT4一直定位于细胞浆，且无Tyr693磷酸化发生。机制研究证实，胞浆STAT4通过与E3泛素连接酶CHIP相互作用，从而阻断CHIP与RIG-Ⅰ的结合，进而阻止CHIP通过K48位多聚泛素化介导RIG-Ⅰ的蛋白酶体降解，继而维持了RIG-Ⅰ蛋白质水平、促进了RIG-Ⅰ诱导的IFN-β产生。
　　综上所述，研究揭示了RIG-Ⅰ信号翻译后调控的一种新方式，并确定了定位于巨噬细胞胞浆的STAT4在抗病毒天然免疫应答中发挥的一种正向调控的新型功能。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

材料和方法

3、主要试剂及材料

4、载体和菌株

5、引物

6、主要设备和软件

二、溶液的配置

1、DEPC(Diethy pyrocarbonate)处理水(1L)

2、10×PBS(1L)

3、大肠杆菌培养基的配制

4、SDS-PAGE溶液配制

5、DNA电泳缓冲液配制(10×TBE)

6、Western Blotting相关溶液

7、硫羟乙酸盐肉汤

8、IP洗液

9、Reticulocyte standard buffer(RSB buffer)

1、小鼠原代腹腔巨噬细胞的分离

2、小鼠骨髓来源的树突状细胞培养

3、小鼠CD8+T细胞分离及培养

4、小RNA干扰

5、RNA提取、cDNA制备和定量PCR

6、细胞因子测定

7、免疫印迹(Western Blot)检测相关蛋白表达

9、质粒构建

10、细胞转染质粒

13、免疫荧光共聚焦实验

14、质谱兼容的硝酸银染色

15、病毒扩增和滴度测定

16、统计学分析

实验结果

一、STAT4在RIG-I信号通路中的调控效应

二、STAT4促进RIG-I信号通路活化不依赖于其经典活化及核转位

三、STAT4正向调控RIG-I信号通路的机制

讨论

小结

参考文献

文献综述 STAT家族与天然免疫研究进展

致谢

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