质谱技术表征不同肺癌微环境中巨噬细胞质膜的表型

摘要

背景和目的:在肿瘤微环境中，巨噬细胞会受到肺癌细胞及其细胞因子的影响而发生相应的免疫反应。巨噬细胞的功能十分复杂，具有抗癌和促癌两种截然相反的功能。抗癌主要表现在巨噬细胞发挥M1型巨噬细胞吞噬和释放抑癌因子的作用、发挥抗原呈递作用并引发适应性免疫反应等。促癌主要表现在抑制T细胞的免疫反应、错误修复受损组织并促进血管生成的作用和保护肿瘤干细胞的作用等。巨噬细胞发挥功能与代谢物质基础改变密切相关，其中代谢物发挥着反应底物和信号通路激活的作用。本研究旨在利用质谱分析技术获得肺癌相关巨噬细胞中具有明显变化的特征代谢物，并结合相关生物学技术获得巨噬细胞活化状态参数的佐证。 材料与方法:研究中选取多种肺癌相关的细胞系（腺癌细胞系A549、鳞癌细胞系H157和木分化大细胞系H460），收集培养后的上清液，并配置成混合培养基来模拟肺癌微环境对单核/巨噬细胞RAW264.7(M0型巨噬细胞)进行刺激，并设置肺组织正常上皮细胞BEAS-2B培养上清液刺激的巨噬细胞作为正常对照组和DMEM合成培养基培养的巨噬细胞作为空白对照组。 用含20％、50％和80％培养上清液的混合培养基对M0型巨噬细胞分别进行24h、48h和72h培养，采用单核/巨噬细胞荧光抗体CD14、M1型巨噬细胞荧光抗体CD16/32和M2型巨噬细胞荧光抗体CD206标记巨噬细胞，并利用流式细胞仪检测;为了更深入的探究肺癌细胞培养上清液对巨噬细胞的影响，设置加入M1型巨噬细胞诱导剂（脂多糖和干扰素γ）的平行实验组，以含80％培养上清液的混合培养基培养巨噬细胞48h后，使用CD16/32进行标记并作流式细胞仪检测，采用CCK-8试剂盒检测细胞活力和采用酶联免疫吸附法试剂盒测定肿瘤坏死因子α浓度。每一种不同处理的巨噬细胞分别在带有玻片的三个培养皿中进行培养，培养48h后对每个巨噬细胞爬片采集三张谱图。采用基质辅助激光解吸电离作为离子化方式，高分辨质谱9.4T apex-ultraTM hybrid Qh-FTICR MS在负离子采集模式(m/z400处分辨率为530，000)下对巨噬细胞爬片进行原位膜脂检测。采用代谢组学分析网站(MetaboAnalyst3.0，http://Www.metaboanalyst.ca/)对质谱采集的数据进行偏最小二乘法判别分析和层次聚类分析，并对检测到的近300个代谢物进行搜库鉴定和二级谱分析。 结果:1）流式细胞技术发现不同肺相关细胞的培养上清液能够抑制M0型巨噬细胞表面膜蛋白CD16/32的表达，并且随着浓度的上升和刺激时间的增加，抑制程度增强，并且M1型巨噬细胞表面膜蛋白CD16/32被抑制的程度不同; 2)CCK-8细胞活性检测方法测定巨噬细胞的活性，发现不同的培养上清液均能够增强巨噬细胞细胞活力(p＜0.01),并且存DMEM培养基中的M1型巨噬细胞活力要强于M0型巨噬细胞(p＜0.01)。在某些培养上清液刺激下，M0和M1型巨噬细胞两者细胞活力差异不明显(p＞0.05); 3)酶联免疫吸附测定方法测定巨噬细胞受到上清液刺激后释放肿瘤坏死因子α到培养基中的浓度，发现培养上清液能够促进M0型巨噬细胞分泌大量肿瘤坏死因子α(p＜0.01)发挥抑癌作用，但是对M1型巨噬细胞却没有显著影响(p＞0.05)。而在同一种培养上清液刺激下，M0型巨噬细胞肿瘤坏死因子α释放量显著高于M1型巨噬细胞(p＜0.01); 4)使用高分辨率质谱检测到近300种小分子代谢物，通过偏最小二乘判别分析发现PE-Cer(d36∶1)与微环境的变化显著相关，并将影响最大的30种代谢物纳入层次聚类分析发现经典活化型巨噬纲胞的定向诱导剂(脂多糖和干扰素γ)对巨噬细胞膜脂的影响与不同肺相关细胞系培养上清液的刺激存在显著差异。通过层次聚类线发现，在使用正常肺组织细胞培养上清液刺激后，M0型巨噬细胞的脂质含量比例与DMEM合成培养基中的M0型巨噬细胞比较接近，而M1型巨噬细胞的脂质含量比例则与受到肺癌细胞培养上清液刺激后的M1型巨噬细胞比较接近。 结论:不同肺癌微环境对巨噬细胞有不同影响。M0型和M1型巨噬细胞本身质膜的差异大于上清液刺激的影响，并发现变化显著的标志物PE-Cer(d36∶1);不同肺癌微环境中膜蛋白CD16/32表达受到抑制，但巨噬细胞的活力增强;不同肺癌微环境中肿瘤坏死因子α被M0型巨噬细胞大量释放，但M1型巨噬细胞没有显著的变化。

目录

论文说明

摘要

第一章序言

一、研究进展

二、研究简介

第二章巨噬细胞在不同肺癌微环境中的蛋白变化

一、背景介绍

二、材料与方法

2．2．1仪器和实验材料

2．2．2上清液制备和细胞系培养

2．2．3细胞活力测定

2．2．4流式细胞技术分型

2．2．5酶联免疫吸附测定法

三、结果

2．3．1流式细胞技术分型结果

2．3．2细胞活力检测结果

2．3．3肿瘤坏死因子α测定结果

第三章巨噬细胞在不同肺癌微环境中的膜脂变化

一、背景介绍

二、材料与方法

3．2．1仪器和实验材料

3．2．2预实验

3．2．3质谱检测

3．2．4数据分析

三、结果

3．3．1方法学探究结果

3．3．2实验结果

3．3．3多因素统计结果

第三章讨论与结论

参考文献

肺癌相关巨噬细胞的研究进展

致谢

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