落叶松IAA受体基因分离与干细胞极性相关miR166及其目标基因功能研究

摘要

落叶松(Larix spp.)是我国北方和西部高山地区具有重要经济和生态价值的针叶树种，而体细胞胚再生体系是进行落叶松分子遗传改良的基础，也是研究裸子植物胚胎发生机制的理想实验材料。受基因型和培养条件的影响，落叶松体细胞胚的诱导经常出现发育畸形，阻碍了实验和生产。生长素及其极性运输在拟南芥等植物胚胎的形态建成中扮演重要角色。已经有研究表明，转录因子HD-ZIPⅢ可能参与生长素的极性运输过程，且HD-ZIPⅢ为miR166的目标基因。但是在裸子植物体细胞胚发育过程中，miR166调控HD-ZIPⅢ，及其与生长素的关系没有相关研究。以落叶松体细胞胚为实验材料，研究了生长素极性运输抑制剂N-1-萘基酞氨酸(NPA)和过表达miR166a对体细胞胚发育的影响，分析了2个生长素受体和4个HD-ZIPⅢ家族成员的基因结构和表达模式，并得到以下结果:
　　 (1)采用NPA处理，模拟生长素极性运输被抑制的突变体，研究生长素极性运输对落叶松体细胞胚发育的影响。结果表明，10 mg/L的IAA和3 mg/L的NPA处理导致原胚团生长缓慢，胚性胚柄结构消失。成熟培养基中加入3 mg/L的NPA，体细胞胚发育出现畸形，子叶融合不展开，顶端呈杯状，胚柄程序化细胞凋亡被延缓，且胚头的生长受到抑制。利用树脂半薄切片观察体细胞胚的显微结构，结果表明NPA处理导致体细胞胚的顶-基胚轴极性无法正常建立，细胞排列紊乱，各组织和器官没有正确有序的进行分化，胚头和胚柄的生长平衡被打破。
　　 (2)通过同源克隆获得了两个生长素受体基因LaAFB1和LaAFB2，两者都具有典型的LRR和F-box结构域。LaAFB1的3'端具有miR393结合位点，其体内切割产物通过RLM-5'RACE技术得到验证，且切割位点发生在miR393的第10和13位碱基，表明落叶松LaAFB1受到miR393的转录后调控。通过检索体细胞胚和幼苗的小RNA测序文库，发现LaAFB1被切割后能产生次级siRNA，且只存在于幼苗小RNA文库中，而不存在于体细胞胚的小RNA文库中，提示miR393介导LaAFB1切割产生的次级siRNA只在落叶松的胚后发育中发挥功能。采用qRT-PCR检测LaAFB1和LaAFB2在落叶松根茎叶等器官和体细胞胚中的表达模式。发现两个基因的表达规律相似，且在成熟体细胞胚中的表达水平最低，表明削弱生长素的信号转导作用，有利于胚胎的发育和成熟。
　　 (3)利用同源克隆和RACE技术获得了4个落叶松HD-ZIPⅢ同源基因的全长cDNA，分别命名为LaHDZ31、32、33和34。它们都具有保守的蛋白结构域:HD、START和MEKHLA。在LaHDZ31-34的START中存在miR165/166的核酸互补序列，进一步采用RLM-5'RACE验证了LaHD Z33和34的体内切割产物，且切割位点均位于miR166的第10位碱基，表明在落叶松体细胞胚发生过程中，LaHDZ31-34受到miR165/166的转录后调控。利用qRT-PCR检测了LaHDZ31-34在正常发生和NPA处理的体细胞胚中的表达规律，结果表明LaHDZ31-34在成熟体细胞胚中的表达量高于原胚团中，且表达最高峰发生在后期单胚阶段。在体细胞胚发育早期，NPA处理的体细胞胚中LaHDZ31-34的表达量比对照高;而在发育的后期阶段，LaHDZ31-33在NPA处理的体细胞胚中的表达量比对照低，但LaHDZ34的表达不受影响。表明LaHDZ31-34与落叶松体细胞胚极性的形成密切相关，LaHDZ34在胚胎发育后期及子叶形成中的功能与其他3个基因不同。
　　 (4)通过qRT-PCR检测了miR166的两个前体基因LaMIR166a和LaMIR166b在落叶松根茎叶、正常发生的体细胞胚和NPA处理的畸形胚中的表达规律，发现两个基因的表达模式明显不同。LaMIR166a在根茎叶中均表达，且在原胚团中的表达水平比成熟体细胞胚中略高;而LaMIR166b在原胚团和叶中不表达，在体细胞胚成熟过程中表达上调。在体细胞胚成熟过程中，miR166及其目标基因存在共表达现象，但是在体细胞胚发育后期，LaMIR166a和LaMIR166b的表达受NPA诱导，其目标基因却受NPA抑制。构建Super启动子驱动LaMIR166a超表达的转化载体，通过农杆菌介导的落叶松胚性细胞的遗传转化，获得了五个抗性细胞系。经PCR检测验证，五个抗性细胞系均为阳性转基因。对过表达LaMIR166a的转基因体细胞胚的表型和显微结构进行观察，结果表明过表达LaMIR166a使胚轴伸长受到抑制，影响子叶的发生和茎顶端分生组织的形态。
　　 过表达LaMIR166a与NPA处理对落叶松体细胞胚顶端形态发育的影响类似，但NPA处理的体细胞胚顶端比过表达LaMIR166a的表型缺陷严重。过表达LaMIR166a与NPA处理的体细胞胚中顶端分生组织标记基因WOX表达上调，提示miR166与生长素对落叶松体细胞胚的形态建成可能具有共同的调控作用。这些实验结果对于进一步研究针叶树体细胞胚发育的分子机制提供理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 研究目的和意义

1．1．3 项目来源与经费支持

1．2 国内外研究现状及评述

1．2．1 植物胚胎发育的形态建成

1．2．2 植物胚胎发育中的生长素调控机理

1．2．3 microRNA在植物胚胎发育中的研究进展

1．2．4 miR166及其目标基因HD-ZIP Ⅲ在植物发育中的研究

1．3 研究目标和主要研究内容

1．3．1 关键的科学问题与研究目标

1．3．2 主要研究内容

1．4 研究技术路线

第二章 生长素对体细胞胚发育的影响及落叶松生长素受体基因的克隆和表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 实验结果

2．2．1 不同IAA浓度对原胚团继代增殖的影响

2．2．2 NPA对原胚团增殖生长的影响

2．2．3 NPA对原胚团胚性胚柄结构的影响

2．2．4 NPA处理对落叶松体细胞胚发育的影响

2．2．5 生长素受体基因的全长cDNA克隆和序列分析

2．2．6 LaAFB1在落叶松体内的microRNA切割产物验证

2．2．7 miR393介导LaAFB1剪切产生次级siRNA的预测

2．2．8 LaAFB1和LaAFB2在落叶松各器官和体细胞胚中的表达模式

2．3 结果分析

2．3．1 生长素在落叶松体细胞胚发生过程中的作用

2．3．2 落叶松生长素受体

2．3．2 落叶松LaAFB1的转录后调控作用

2．4 小结

第三章 落叶松miR166的目标基因LaHDZ31-34的克隆和表达分析

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 落叶松LaHDZ31-34全长cDNA克隆

3．2．2 基因序列分析

3．2．3 分子进化树构建

3．2．4 HD-ZIP Ⅲ的microRNA切割位点验证

3．2．5 LaHDZ31-34在落叶松体细胞胚发育中的表达模式

3．3 结果分析

3．3．1 针叶树中的HD-ZIP Ⅲ基因家族

3．3．2 LaHDZ31-34表达模式和落叶松体细胞胚极性建成

3．3．3 体细胞胚发育过程中miR166对LaHDZ31-34的转录后调控

3．4 小结

第四章 miR166a在落叶松体细胞胚发育中的功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 落叶松体细胞胚及遗传转化受体材料的培养

4．1．2 植物超表达载体构建

4．1．3 农杆菌介导的落叶松胚性细胞的遗传转化

4．1．4 转基因落叶松体细胞胚的表型及显微结构观察

4．1．5 qRT-PCR

4．2 实验结果

4．2．1 miR166编码基因在落叶松器官水平及体细胞胚发生中的表达模式

4．2．2 植物超表达载体和转LaMIR166a基因抗性细胞的获得

4．2．3 转LaMIR166a落叶松胚性细胞系的分子检测

4．2．4 过表达miR166a落叶松体细胞胚的表型分析

4．3 结果分析

4．3．1 植物中的miR165／166基因

4．3．2 miR166对其目标基因的转录后调控

4．3．3 miR166a在落叶松体细胞胚发育中的功能

4．4 小结

第五章 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．3 展望

参考文献

附录 缩略词

在读期间的学术研究

致谢