重组白喉毒素-人白细胞介素13毒素融合蛋白活性研究

摘要

恶性肿瘤是人类生命的最严重的威胁之一,常规治疗手段对于大多数恶性肿瘤的治疗效果都不理想,并且外科手术给患者带来极大的痛苦。毒素融合蛋白可以特异性杀伤肿瘤细胞,具有副作用低、高效的特点,因此在抗肿瘤治疗等方面,显示出良好的应用前景。在前期研究中我们发现毒素融合蛋白DT389-hIL13可特异高效地杀伤高表达IL13Rα2的神经胶质瘤细胞,但是这样构建的DT389-hIL13由于分子量较大导致穿透能力低,易于降解,对于肿瘤细胞的杀伤作用有待进一步提高。为了提高DT389-hIL13的稳定性,本研究对DT389-hIL13的结构进行了改造,拟通过对结构的改造提高融合蛋白的稳定性,增强其对肿瘤细胞的杀伤作用。同时,为了实现该毒素的大规模制备,我们对下游的复性和纯化工艺进行了初步研究。
　　 为了与前期实验中构建的重组表达质粒以及表达的毒素融合蛋白区分开来,重组表达质粒和融合蛋白名称前面均加入前缀modified。本实验以前期实验构建的重组表达质粒pET-30a(+)/DT389-hIL13为模板,使用PCR的方法扩增并连接DT389片段和hIL13片段,首次使用连接肽GGGGS将两个片段连接并删除了IL13片段中多余的氨基酸,希望能够使两个结构域更好地独立折叠,提高其复性效率,从而构建了新的原核表达质粒modified-pET-30a(+)/DT389-hIL13。将本实验和前期实验中构建的重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,实现了融合蛋白的高效原核表达。采用凝胶过滤层析和离子交换层析对融合蛋白复性并进行纯化后,通过测定其对脑神经胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用来评价其活性。在体外实验中,将复性纯化后的融合蛋白稀释为5个浓度梯度(1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M),在三个时间点(24、48、72h)测定其对U251细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。同时,我们分别用凝胶过滤层析和离子交换层析作为蛋白柱上复性系统,研究了不同的复性和纯化路线对其活性和产率的影响。
　　 实验结果显示,成功构建了含毒素融合蛋白基因片段modified-DT3s9-hIL13的原核表达质粒pET-30a(+)/modified-DT389-hIL13。采用原核表达系统对毒素融合蛋白DT389-hIL13和modified-DT389-hIL13进行表达、纯化,比较两者之间的纯度,回收率和活性。复性和初纯化后的目的蛋白纯度可达到DT389-hIL1389％和modified-DT389-hIL1385％,回收率分别为45％和40.3％。进一步纯化后纯度可达到DT389-hIL1398％和modified-DT389-hIL1394％,回收率则分别为37.5％和33.3％。二者均获得较为理想的纯化效果。对神经胶质瘤细胞系U251的半数致死浓度分别为:1.025×10-8M和5.159×10-8M。毒素融合蛋白modified-DT389-hIL13的活性和DT389-hIL13相比较,其对肿瘤细胞的杀伤作用并未有所提高。其原因可能是linker GGGGS对modified-DT389-hIL13结构的重折叠没有起到预期的辅助作用。比较不同的复性和纯化路线对融合蛋白DT389-hIL13活性和产率的影响。证实了弱结合型离子交换剂DEAE对蛋白质的吸附作用较弱,可有效减少蛋白损失,提高蛋白回收率。从初步实试验结果来看凝胶过滤层析和离子交换层析对DT389-hIL13的复性效果基本相同。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1 引言

2 研究目的和内容

2.1 研究目的

2.2 研究内容

2.2.1 重组表达质粒modified-pET-30a(+)/DT389-hIL13的构建

2.2.2 改造前后毒素融合蛋白的表达与纯化

2.2.3 改造前后毒素融合蛋白的体外活性测定

2.2.4 毒素融合蛋白DT389-hIL13的复性、纯化路线

3 实验材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 细菌菌株及细菌培养所用主要试剂

3.1.2 质粒

3.1.3 细胞株及细胞培养所用培养基

3.1.4 主要试剂和试剂盒

3.1.5 主要实验仪器及耗材

3.1.6 主要溶液的配制

3.2 实验方法

3.2.1 原核表达质粒modified-pET-30a(+)/DT389-hIL13的构建

3.2.2 毒素融合蛋白的表达与纯化

3.2.3 细胞实验

4 实验结果

4.1 原核表达质粒pET-30a(+)/modified-DT3sg-hIL13的构建

4.2 毒素融合蛋白的表达与纯化

4.2.1 毒素融合蛋白的诱导表达

4.2.2 毒素融合蛋白的复性、纯化和鉴定

4.2.3 体外活性测定

4.3 不同复性和纯化路线的比较

4.3.1 凝胶过滤层析复性-离子交换纯化

4.3.2 离子交换层析复性纯化-凝胶过滤层析分析

4.3.3 体外活性测定

5 讨论

5.1 hIL13基因的改造及毒素融合蛋白modified-DT389-hIL13表达载体的构建

5.2 毒素融合蛋白的诱导表达

5.3 毒素融合蛋白的复性和纯化

5.4 不同复性和纯化路线的比较

6 结论

参考文献

附录A

作者简历

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