中国北方人2型糖尿病易感基因PPARGC1的分子遗传学研究

摘要

2 型糖尿病（T2DM）是最常见的一类慢性代谢性疾病，严重威胁现代人类的生活质量，其遗传病因学十分复杂，由于遗传异质性的存在，不同群体中分子遗传学的研究结果很难得到重复。肝细胞中特异表达的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1（PPARGC1）在T2DM 的胰岛素抵抗（IR）发生机制中起关键作用，作为转录辅激活因子，由于其特征性参与糖代谢、脂代谢和线粒体能量代谢的调节，近年来被密切关注。为阐明其在中国北方人群中T2DM 的风险贡献并探索其分子机制，本研究采用两条线路，即基因组遗传学研究和功能基因组学策略同步进行研究。 首先第一步通过北京T2DM 患者中小样本的PPARGC1 基因编码区和启动子区进行SNP 扫描，共识别9 个SNP 位点。根据最小等位基因频率（MAF）和杂合度，筛选其中6 个SNP 位点作为侯选SNP，基于“病例-对照”研究的设计在北京T2DM小群体中（n=216），进行预分型研究，LD 分析发现6 个SNP 分处于两个LD 域中，第2 个LD 域中的SNP 有与T2DM 关联的趋势。随即在另一个来自哈尔滨T2DM 的大群体中（n=915），我们对位于此域中的3 个SNP 进行了进一步分析，结果发现，394G 等位基因的携带（P=0.018）、482G 等位基因的携带（P=0.042），均是独立于年龄、性别的T2DM 发生的保护因素；612C 等位基因的携带也能降低T2DM 的风险（P=0.052）。基于LD 的支持，我们继续在此人群中进行了三个位点的单体型分析，并发现了两种单体型的携带能够降低T2DM 的风险：394G*482G（P=0.012，OR=0.778）、482G*612C（P=0.048，OR=0.921）。最后，我们将这三个位点在家系中进行了TDT/sTDT/cTDT 研究，结果发现，482A 风险等位基因在家系中传递给受累患者的几率高于野生型（PTDT=0.048）。对于识别的482 位点和612 位点风险等位基因组成的单体型，我们设计定点突变进行克隆，基于荧光素酶的转录激活实验发现，同时含有两个位点双突变的单体型的PPARGC1，其在HepG2 细胞中的活性高于野生型，并且能使PPARGC1 有在nuclear speckle 中积聚的趋势。 第二步利用功能基因组学和人类新功能基因的高通量细胞筛选平台，通过对近600 个功能未知的ORF 文库中的基因克隆进行筛选，初步发现11 个新基因能调节PPARGC1 启动子的活性。其中7 个为激活基因，4 个为抑制基因。通过截断体实验和电泳迁移率改变实验发现，其中有两个抑制基因OTEX、C9orf90 超表达后，对细胞内源性PPARGC1 在转录和翻译水平仍可存在一定程度的抑制效应，并且其可能需要CRE 元件发挥作用。但是，此过程中并不影响对CREB-Ser133 的磷酸化状态，为具体对这两个基因进行深入研究提供了初步的功能线索。