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【6h】

MicroRNA-148a诱导肝纤维化大鼠原代肝星状细胞自噬作用的研究

目录

声明

中 文 摘 要

前言

1肝纤维化与原代肝星状细胞

2 自噬概述

3 MiRNAs与自噬

4 MiR-148a与HSCs自噬

5本实验的研究内容

实 验 材 料

1、实验动物

2、主要试剂

3、主要仪器

实 验 方 法

1、主要实验试剂配制

2、提取大鼠原代HSCs

2.1肝纤维化造模

2.2验证肝纤维化

2.3 HSCs的分离术前准备

2.4分离HSCs

3、基本方法

3.1 细胞培养

3.2 细胞传代

3.3 细胞冻存

3.4 细胞复苏

4、细胞转染

5、透射电镜观察细胞自噬小体情况

6、Western blot检测原代HSCsLC3-Ⅱ、SQSTM1/P62的表达及LC3类别转换

6.1总蛋白抽提

6.2 蛋白样品初步定量

6.3 SDS-PAGE电泳

6.4 蛋白质转移

6.5 免疫印记

7、激光扫描共聚焦显微镜检测绿色荧光斑点

7.1共转染

7.2激光扫描共聚焦显微镜观察细胞绿色荧光斑点情况

7、统计学分析

实 验 结 果

1、肝纤维化验证

2、透射电镜观察HSCs自噬小体

3、Western blot检测原代HSCs自噬相关蛋白的表达

4、激光扫描共聚焦显微镜检测GFP-LC3绿色荧光蛋白

讨论

一、MiR-148a与原代HSCs自噬

二、HSCs自噬与肝纤维化

三、总结与展望

结论

参 考 文 献

部 分 缩 略 词 表

在校期间发表论文、专利及参与科研情况

致谢

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摘要

目的检测miR-148a(microRNA-148a)诱导肝纤维化大鼠原代肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)自噬相关标志物的表达,探究其对自噬作用的影响。  方法将SD大鼠分成正常组、溶剂组及肝纤维化模型组培养,造模成功后分离出原代HSCs。接下来实验分两部分,其一是直接采用透射电镜检测各组HSCs自噬小体;利用蛋白印迹法检测各组HSCs自噬相关蛋白LC3及SQSTM1/P62;采用激光扫描共聚焦显微镜检测各组HSCs绿色荧光蛋白。其二是将模型组原代HSCs转染miR-148amimic、miR-148ainhibitor后,再采用透射电镜检测自噬小体;利用Westernblot检测自噬相关蛋白LC3及SQSTM1/P62;在GFP-LC3及miR-148a共转染原代HSCs后,采用激光扫描共聚焦显微镜检测绿色荧光斑点形成。  结果1、透射电镜示:造模成功后,可观察到模型组HSCs形成的自噬小体比正常组及溶剂组HSCs明显增多,HSCs自噬增强;模型组转染miR-148amimic或miR-148ainhibitor后,观察到转染miR-148amimic组HSCs的自噬小体比对照组多,自噬作用增强;反之,转染miR-148ainhibitor组的HSCs中自噬小体比对照组少,自噬作用受到抑制。2、Westernblot示:造模成功后,与正常组及、溶剂组相比,模型组LC3-Ⅱ的表达、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换更明显,自噬作用增强;在模型组中,miR-148amimic皆可促进LC3-Ⅱ表达、LC3类别转换和SQSTM1/P62降解,诱导自噬;而miR-148ainhibitor则可以抑制LC3-Ⅱ表达、LC3类别转换和SQSTM1/P62降解,抑制自噬。3、激光扫描共聚焦显微镜示:在转染之前,与正常组、溶剂组相比,模型组检测出的绿色荧光斑点更多,自噬作用增强;在模型组中,与对照组相比,转染miR-148amimic的HSCs可检测出更多的绿色荧光斑点,聚集效应更明显,自噬作用更强;转染miR-148ainhibitor的HSCs检测出的绿色荧光斑点较少,荧光蛋白聚集不明显,自噬作用受抑。  结论1、肝纤维化时HSCs自噬作用增强。  2、MiR-148a可诱导肝纤维化大鼠原代HSCs自噬活性。

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