酿酒酵母氧化应激反应中一组氧化还原酶的结构和功能研究

摘要

活性氧(reactive oxygen speices，ROS)是由细胞正常的有氧代谢产生或因暴露于诱导自由基产生的化合物，如超氧阴离子(·O<,2><'->)、过氧化氢(H<,2>O<,2>)及羟自由基(·OH)。当这些物质积累到一定的浓度时，就会导致细胞内大分子物质(脂质、蛋白质、DNA)发生氧化变性、交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，甚至造成细胞的死亡。酿酒酵母拥有酶系和非酶系抗氧化系统来清除细胞内的自由基，并维持细胞内正常的还原状态。其中还原过氧化氢的最主要的两个途径分别为谷氧还蛋白系统(NADPH-Glr1-GSH-Grx)和硫氧还蛋白系统(NADPH-Trr1/2-Trx-Prx)。我们分别表达纯化了这两个系统中的部分蛋白，并通过蛋白质晶体学和体外生化实验来研究其结构和功能上的相互关系，从而帮助我们构建氧化应激条件下蛋白之间相互作用网络。 我们解析了酿酒酵母谷胱甘肽还原酶Glr1的氧化态的晶体结构。通过对大肠杆菌、人和酵母谷胱甘肽还原酶同源结构的分析发现，三者皆为同二聚体，整体结构比较一致，且活性位点残基高度保守，但在二聚体相互作用界面上存在着较大的差异。Glr1蛋白表面的半胱氨酸Cys239被谷胱甘肽修饰(glutathionylation)。尽管这一修饰并没有对局部结构造成影响，但是Cys239位于底物GSSG进入通道的附近，这里同时也是其还原产物GSH的离开通道；同时谷胱甘肽化也是蛋白保护自由巯基或调节酶活的方式之一，因此这一位置的谷胱甘肽化对于蛋白活性的维持可能有一定的作用。同时，我们发现Glr1中位于电子供体NADPH进入位点附近的Asn278被糖基化修饰，形成约20个糖基的寡糖链。我们通过体外酶活实验鉴定了重组表达蛋白和天然蛋白的酶学动力学参数，确定了Asn278的糖基化降低了蛋白的催化活性。 对酿酒酵母谷氧还蛋白Grxl氧化型和谷胱甘肽化型结构的分析表明，伴随Cys27和Cys30之间二硫键的断裂，活性位点CPYC附近的残基发生了较大的构象变化。同时我们根据谷胱甘肽化的Grx1的结构揭示了其GSH结合相关的重要氨基酸残基以及它们在稳定结合的谷胱甘肽分子中所起到的作用。酿酒酵母Grx1和Grx2虽然同属于双巯基谷氧还蛋白亚家族，其活性位点同为CPYC，两者之间的氨基酸序列一致性也高达64％，但是两者在各自缺陷菌株的现象却各不相同。通过Grx2氧化型和还原型两种晶体结构，我们发现Grx2由于氧化还原状态的不同所导致的构象变化与Grx1中发现的构象变化相类似。而在对Grx1谷胱甘肽化型结构和Grx2还原型结构的比较中我们发现，位于谷胱甘肽结合位点的γ-谷氨酸一端与Grx1的Asp89之间形成较强的相互作用，而在Grx2中相应的位点变成Ser123，导致γ-谷氨酸一端与Grx2之间相互作用的削弱，从而降低GSH的结合能力，并进一步通过ITC实验证明Grx1对GSH的亲和力要明显高于Grx2。Grx1位于细胞质和细胞核，而Grx2位于细胞质和线粒体中。不同的细胞定位存在这不同的氧化还原环境，尤其是GSH的浓度上的差异。而正是Grx1和Grx2对于GSH的亲和力的不同，导致了两者在细胞中生理作用的差异。我们还解析了酿酒酵母烷基过氧化物还原酶Ahp1氧化型的晶体结构，发现其在一个非对称单位中以同二聚体的形式存在，并形成了Cys31和另一个亚基中Cys62形成分子间的二硫键，同时其二聚体相互作用界面垂直于中心的β-sheet。但之前的文献报道称Ahp1在催化反应中应形成了Cys62与另一个亚基的Cys120的分子间二硫键，这与我们解析的晶体结构中的结果相冲突。于是我们进一步构建了Ahp1的C31S，C62S和C120S三个突变体，并检测其分子间二硫键的形成以及体外生化活性，并证实了我们的结果，即具催化活性半胱氨酸残基为Cys31和Cys62，而非Cys120。 文献报道Ahp1被泛素相关修饰蛋白Urm1共价修饰。由于Ahp1在氧化应激反应中在还原细胞内的过氧化物中起到重要的作用，这表明Urm1修饰体系在氧化应激中可能起到一定的调控作用。为此我们解析了Urm1的晶体结构，发现其整体结构与其溶液结构基本一致，不同在于其C末端肽链没有伸入溶剂区，而是叠加到分子上方并可能介导了二聚体的形成。我们通过体积阻滞鉴定Urm1在溶液中的分子量，并利用变复性实验来检测异源二聚体Urm1/Urm1-6xHis-tag的存在，证实了我们的猜测。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章酿酒酵母谷氧还蛋白系统及硫氧还蛋白系统

1.1酿酒酵母及氧化应激反应

1.2谷氧还蛋白系统

1.3硫氧还蛋白系统

1.4毕赤酵母表达系统

第2章谷胱甘肽还原酶Glr1的晶体结构及生化分析

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1分泌型表达载体pPIC9K的构建

2.2.2蛋白表达检测

2.2.3蛋白表达纯化

2.2.4蛋白结晶，衍射数据收集处理及结构解析

2.2.5 Cys239谷胱甘肽化修饰的体外鉴定

2.2.6酶活检测与酶学动力学研究

2.3实验结果与讨论

2.3.1 Glr1整体结构

2.3.2二聚体相互作用界面

2.3.3表面半胱氨酸Cys239谷胱甘肽化修饰

2.3.4糖基化位点Asn278及酶学动力学研究

第3章谷氧还蛋白Grx1与Grx2不同氧化还原状态的晶体结构分析及活性差异分析

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1 Grx1表达载体的构建

3.2.2 Grx2载体的构建

3.2.3蛋白表达纯化

3.2.4蛋白结晶，数据收集处理及结构解析

3.2.5 ITC方法测定Grx1与Grx2对GSH的解离常数

3.3实验结果与讨论

3.3.1 Grx1整体结构

3.3.2 Grx1中GSH结合位点

3.3.3 Grx1中氧化还原导致的构象变化

3.3.4 Grx2整体结构

3.3.5 Grx2中氧化还原导致的构象变化

3.3.6还原型Grx2与谷胱甘肽化型Grx1的结构比较

3.3.7 Grx1与Grx2对GSH结合能力的比较

第4章烷基过氧化物还原酶Ahp1及类泛素修饰蛋白Urm1的晶体结构研究

4.1烷基过氧化物还原酶Ahp1的晶体结构及其催化活性半胱氨酸的鉴定

4.1.1引言

4.1.2材料与方法

4.1.3实验结果与讨论

4.2类泛素修饰蛋白Urm1的晶体结构及聚合状态研究

4.2.1引言

4.2.2材料与方法

4.2.3实验结果与讨论

第5章结论与展望

参考文献

附录实验试剂

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果

参加的学术会议

攻读博士学位期间完成的其他工作