益肾颗粒通过干预氧化应激反应治疗糖尿病肾脏疾病的作用机制研究

摘要

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)是由糖尿病引起的慢性肾脏病，临床上以持续白蛋白尿或(和)肾小球滤过率进行性下降为特征，可进展为终末期肾病。DKD是糖尿病的主要微血管并发症之一，我国约20％一40％的糖尿病患者合并DKD，造成巨大的社会和经济负担。本研究基于数据挖掘方法分析张宁教授中医治疗糖尿病肾脏疾病的用药规律，并在糖尿病肾脏疾病大鼠模型上验证张宁教授创制的益肾颗粒对于DKD的治疗作用，观察益肾颗粒对氧化应激反应的作用，以初步探究其治疗DKD的机制。　　第一部分　　基于数据挖掘方法分析张宁教授中医治疗糖尿病肾脏疾病的用药规律　　目的:分析张宁教授中医治疗糖尿病肾脏疾病的用药规律，包括常用药物、药物分类、组方规律，以初步提炼张宁教授中医治疗糖尿病肾脏疾病的学术思想。　　方法:收集2014年1月-2018年12月张宁教授在望京医院诊治的糖尿病肾脏疾病有效病例，共纳入处方1045首，药味195味。利用中医传承辅助平台(V2.5)，录入患者基本信息、诊断、方药等信息，采用一人录入双人审核的制度，确保数据的准确性，建立张宁教授治疗糖尿病。肾脏疾病的方药数据库。通过选择“中医传承辅助平台V2.5”中的“统计报表”“数据分析”功能，进行具体数据的统计分析，制作表格。包括用药频次分析、组方规律分析。　　结果:(1)用药频次分析显示:出现频次≥200的中药有29味，其中前10位分别是:黄芪、丹参、柴胡、生薏苡仁、石韦、白芍、酒大黄、茯苓、当归、地龙。(2)药物分类使用频率分析显示，使用频率居前五位分别是:活血化瘀药，清热药，利水消肿药，补气药，利尿通淋药，补阴药，补血药，补阳药，收涩药，化痰止咳平喘药。(3)基于关联规则的常用药物用药模式显示:支持度＞300的用药模式有19个，排在前5位的药物组合是:黄芪-生薏苡仁、黄芪-石韦、丹参-黄芪、黄芪-柴胡、石韦-生薏苡仁。(4)常用药物规则分析显示:置信度＞0.90的关联规则共有21条，按照置信度由高到低排列，前5条分别是:茯苓，石韦-＞黄芪;丹参，石韦，生薏苡仁-＞黄芪;地龙，生薏苡仁-＞黄芪;石韦，地龙，生薏苡仁-＞黄芪;地龙-＞黄芪。　　结论:张宁教授临床治疗糖尿病肾脏疾病的常以黄芪、太子参、山药等健脾益肺，益气养阴;生地黄、玄参等清热凉血，养阴生津;白芍、当归等养血;丹参、地龙等活血;茯苓、生薏苡仁等健脾渗湿;石韦、桑白皮等利水消肿;山茱萸、狗脊、续断等补益肝肾;佛手、柴胡、香附等疏肝理气。常用的药物种类有活血化瘀药，清热药，利水消肿药，补气药，利尿通淋药，补阴药，补血药，补阳药等等。组方规律体现了补气生血、益气活血、利水活血相结合、前后分消、疏肝活血等思想。结果体现了张宁教授在糖肾早期以益气养阴，清热生津为主要治法;中期在此基础上加以养血活血，健脾祛湿之法;晚期补益肝肾，利尿消肿为主的学术思想。　　第二部分　　益肾颗粒通过干预氧化应激反应治疗糖尿病肾脏疾病的作用机制研究　　目的:运用高糖高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素(streptozocin，STZ)腹腔注射建立的糖尿病肾病大鼠模型，观察益肾颗粒对DN大鼠一般状况、血糖、血脂、肾功能、肝功能、尿蛋白、肾脏病理、氧化应激反应等方面的干预作用，验证益肾颗粒治疗糖尿病肾脏疾病的作用及安全性，并初步探究其机制。　　方法:将60只雄性SD大鼠随机分为正常组(10只)和造模组(50只)。正常组予普通饲料喂养;造模组予高糖高脂饲料喂养联合低剂量STZ(30mg/kg)腹腔注射，建立糖尿病肾病大鼠模型。将成模的45只大鼠依照随机区组法按体重随机平均分为:模型组，氯沙坦钾组，益肾颗粒组，每组均15只;10只健康雄性SD大鼠为正常组。第10周开始干预，正常组、模型组予以等体积的蒸馏水灌胃;益。肾颗粒组灌胃剂量为1.789/kg;氯沙坦钾组按照氯沙坦钾20mg/kg进行灌胃，连续灌胃干预10周。干预前测量大鼠体重，于眶静脉取血1ml用于检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、白蛋白(albumin，ALB)、血肌酐(creatinine，CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALB);干预5周后，测量大鼠体重;于眶静脉取血1ml用于检测FBG、TG、TC、ALB、CRE、BUN。干预10周后，用代谢笼收集大鼠24小时尿，检测24小时尿蛋白定量;后腹主动脉取血，检测FBG、TG、TC、ALB、CRE、BUN、AST、ALT，以及氧化应激反应指标:总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。　　取出大鼠双侧肾脏，称重并记录，用于肾脏病理检测。HE、PAS染色后光学显微镜下观察肾小球、肾小管间质结构改变。通过Motic3000显微摄影系统采集病理图片，通过Image-J半定量方法评估肾小球病理变化程度。PAS染色400×光镜下，每张片子随机选取3个带有肾小球的视野，每组3张片子。采用Image-J算出每个肾小球总面积、肾小球系膜基质面积，计算系膜基质面积与肾小球总面积的比值，作为一个肾小球病理变化程度的评估。　　结果:(1)造模组大鼠特点:经过高糖高脂饮食饲养和低剂量STZ腹腔注射造模，与正常组大鼠相比，造模组出现明显的多食、多饮、多尿症状，体重降低(P＜0.01)，FBG、TC、BUN、ALT升高(P＜0.01)，血浆ALB降低(P＜O.05)。(2)干预10周后各组大鼠一般状况、体质量、尿量:与正常组相比，模型组大鼠出现体型消瘦，毛色蜡黄，活动减少，精神暴躁，眼球发白等病态改变;与模型组大鼠相比，益肾颗粒组大鼠和氯沙坦钾组大鼠均有改善。与正常组相比，模型组体质量降低(P＜0.01)，尿量升高(P＜0.01)。与模型组相比，益肾颗粒组、氯沙坦钾体质量、尿量无统计学差异。(3)干预10周后各组大鼠血糖、血脂、血浆白蛋白:与正常组相比，模型组FBG、TC(P＜0.01)、TG(P＜0.05)升高，血ALB降低(P＜0.01)。与模型组相比，益。肾颗粒组FBG降低(P＜0.05)，血ALB升高(P＜0.01);氯沙坦钾组、益’肾颗粒组TG、TC均降低(P＜0.01)。(4)干预10周后各组大鼠肾功能:与正常组相比，模型组BUN升高(P＜0.01);血CRE无统计学差异。与模型组相比，氯沙坦钾组、益肾颗粒组BUN降低，差异无统计学意义(P＞0.05)。(5)干预10周后各组大鼠24hUTP:与正常组相比，模型组24hUTP升高(P＜0.01)。与模型组相比，氯沙坦钾组(P＜0.05)、益肾颗粒组(P＜O.01)24hUTP降低。(6)干预10周后各组大鼠肝功能:与正常组相比，模型组ALT升高(P＜0.01);与模型组相比，益肾颗粒组ALT降低(P＜0.05)。(7)氧化应激反应指标:与正常组相比，模型组血清T.SOD(P＜0.01)、GSH-PX含量降低(P＜0.05)。与模型组相比，氯沙坦钾组血清T。SOD升高、MDA含量降低(P＜O.01);益肾颗粒组GSH—PX含量升高(P＜0.05)，T-SOD升高、MDA含量降低(P＞0.05)。(8)肾脏病理:HE、PAS染色显示，与正常组相比，各造模组出现肾小球体积增大、基底膜增厚、系膜基质增多等病理改变。与模型组相比，氯沙坦钾组、益肾颗粒组病理改变明显减轻。计算肾小球系膜面积与肾小球总面积的百分比，与正常组相比，模型组系膜面积分数明显升高(P＜0.01);与模型组相比，氯沙坦钾组、益肾颗粒组系膜面积分数明显降低(P＜0.01)。　　结论:益肾颗粒可以改善糖尿病肾病大鼠的一般状况，降低FBG、TG、TC、ALT、24hUTP，升高血ALB;有降低血BUN的趋势，且能够减轻DN大鼠基底膜增厚、系膜增生等肾脏病理改变，降低。肾小球系膜面积分数;并且对氧化应激反应有一定抑制作用。说明益。肾颗粒可以改善糖尿病肾病大鼠的一般状况，降低血糖、血脂、尿蛋白，升高血浆白蛋白，有降低血尿素氮的趋势，可以显著减轻肾脏病理损伤，具有肾脏保护作用，且安全性良好。益肾颗粒能在一定程度上抑制氧化应激反应，这可能是其肾脏保护机制的所在。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

文献综述

综述一糖尿病肾脏疾病的研究进展

综述二糖尿病肾脏疾病的中医药研究进展

前言

第一部分基于数据挖掘方法分析张宁教授中医治疗糖尿病肾脏疾病的用药规律

资料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分益肾颗粒通过干预氧化应激反应治疗糖尿病肾脏疾病的作用机制研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

不足与展望

致谢

个人简历