血管生成素-2(AngiopoietiN-2)调节小鼠下肢缺血血管生成的研究

摘要

目的:研究血管生成素-2（Angiopoietin-2）在下肢缺血模型的实验小鼠中，对缺血部位血管生成的作用机制。　　方法:1.建立C57/BL6小鼠下肢缺血模型及腹腔给药:麻醉实验小鼠后，经股深动脉下缘和胭动脉上缘结扎实验小鼠左侧股动脉干支，并且离断双结之间股动脉干支，缝合皮肤，复温后，应用激光多普勒仪记录实验小鼠双下肢血流灌注情况，在结扎前(pre)，1d，3d，5d，8d，各记录一次血流情况。计算左腿与右腿的血流比值，即结扎侧与非结扎侧的比值。将实验小鼠分为两组，对照组和给药组，各组为3只实验小鼠，对照组经腹腔注射给予等量的生理盐水，给药组腹腔注射重组人血管生成素-2（recombination-human-Ang-2），在结扎日(1d)，3d，5d，各给药一次。在第8d处死实验小鼠，经下腔静脉取抗凝血，离心，取上清液;取双侧下肢肌肉，包括内收肌和腓肠肌。2.ELISA法检测血清中rh-Ang-2的含量:取实验小鼠离心后的血清，按ELISA试剂盒操作说明检测血清中rh-Ang-2的含量。3.实时荧光定量PCR分析待测组织样品中目的基因的表达:用液氮研磨实验小鼠肌肉组织，用trizol裂解研碎的组织，传统法抽提总RNA，琼脂糖凝胶电泳分析所提RNA质量，逆转录合成cDNA，实时荧光定量PCR仪分析目的基因的表达，包括Ang-1，Ang-2，PDGF-BB，PDGFR-β，VEGF-A，VEGF-C。4.应用免疫荧光法分析小鼠肌肉血管生成情况:取小鼠下肢肌肉，以4％多聚甲醛固定，送病理科以石蜡包埋，并制成病理切片，用anti-α-SMA做免疫荧光分析，靶向标记血管周细胞，计算新生血管的平均管径。5.体外血管平滑肌细胞培养研究Ang-2对PDGF-BB信号通路的影响:用培养皿培养人脐静脉血管平滑肌细胞(HUVSMC)，设置4各组，分别为空白组(control)，Ang-2组，PDGF-BB组，Ang-2+PDGF-BB组，在无血清培养基情况下，在各组中加入对应处理因素，分别做了细胞划痕实验和蛋白质印迹实验。6.统计方法:采用spss17.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　结果:1.Ang-2对下肢缺血小鼠模型血流灌注恢复情况的影响:对照组实验小鼠内收肌血流自结扎日起，血流逐渐增大，而Ang-2组血流增加不明显;而相比腓肠肌血流变化，对照组与Ang-2组无明显差异。2.血清ELISA结果显示，对照组血清rh-Ang-2未检出，Ang-2组血清中检出rh-Ang-2。3.实时荧光定量PCR结果显示，Ang-2组实验小鼠缺血测内收肌中，促血管生长因子Ang-1，Ang-2，PDGF-BB，VEGF-A，VEGF-C的表达量下降。4.免疫荧光显示Ang-2组实验小鼠下肢缺血测内收肌平均血管管径小于对照组。5.细胞划痕实验显示，PDGF-BB组划痕距离恢复最快，Ang-2+PDGF-BB次之，Ang-2最慢，Ang-2阻止PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移;蛋白质印迹实验显示，Ang-2+PDGF-BB组中PDGFR-β受体的磷酸化被抑制，表明Ang-2阻止PDGF-BB增加的PDGFR-β受体的磷酸化。　　结论:1.Ang-2减少下肢缺血灌注，抑制内收肌血管的生成与成熟，对腓肠肌血管新生的影响不明显。2.rh-Ang-2不存在于对照组小鼠中，而存在于给药组实验小鼠血清中，并影响其血管生成。3.Ang-2下调了内收肌血管生成中促血管因子Ang-1，Ang-2，PDGF-BB，VEGF-A，VEGF-C的表达。4.Ang-2抑制缺血测内收肌平均血管管径的增大。5.Ang-2减弱或者抑制了PDGF-BB/PDGFR-β信号通路。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1．Ang-2小鼠下肢缺血血流灌注

2．血清ELISA结果

3．实时荧光定量PCR扩增效果及分析

4．Ang-2减少新生血管管径

5．Ang-2阻止PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移

6．Ang-2抑制PDGF-BB诱导的PDGFR-β磷酸化

讨论

1．Ang-2在血管生成中扮演的角色

2．Ang-2对壁细胞的影响机制

3．Ang-2应用于临床治疗的展望与问题

结论

参考文献

英汉缩略词表对照表

致谢

肿瘤血管病变与血管正常化研究进展 综述

声明