综合应用液体核磁共振和电生理方法揭示钾离子通道调节亚基对通道亚基的作用机制

摘要

无论是动物还是植物，单细胞生物或者是多细胞生物，都无一不含有离子通道;并且离子通道的种类也多种多样。现如今，对离子通道的研究主要是采用膜片钳等技术记录其电流，进而了解其功能，再结合其他方法和技术对离子通道的功能与结构进行研究。本文综合应用液体核磁共振和电生理技术对离子通道重要家族-钾离子通道的调节亚基家族蛋白的结构和功能进行相关研究;论文共分为四章。
　　第一章简单介绍了离子通道的基本知识和离子通道的研究方法。首先介绍了离子通道的基本特征与功能，接着对本文的主要研究对象钾离子通道家族和钾离子通道的辅助亚基家族进行描述，最后介绍了离子通道的主要研究方法膜片钳技术。
　　第二章是钾离子通道调节亚基KCNE2对KCNQ1通道的调控的研究。本文内容是在我们实验室赖超华同学（已毕业）的已经解析的KCNE2蛋白结构的基础上，对KCNE2蛋白对KCNQ1通道的功能调控进行了研究。
　　KCNQ1通道的电导和动力学可由不同的单一跨膜螺旋的辅助蛋白（如KCNE1，KCNE2等）进行调制。尽管KCNE2和KCNE1具有相对较高的二级结构同源性，但是它们的三级结构是不同的，这可能是它们对KCNQ1调控作用不同的重要原因。在本章中，我们综合应用电生理学，免疫荧光法，液体NMR和相关动力学模拟等方法对KCNE1和KCNE2的不同结构域进行了比较研究。
　　第三章介绍了另外一个钾离子通道调节亚基MPS1的结构和功能。MPS1是最先在线虫中发现的KCNE家族成员。曾有报道说MPS1的胞内羧基末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，然而我们用液体核磁共振方法解析MPS1的结构发现其胞内羧基端是一个高柔性无序卷曲构象。这个结果表明，MPS1蛋白单独存在时，其羧基末端不可能形成稳定的三维折叠，因此不太可能是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，并且功能实验也同样证明其无激酶活性。
　　第四章对另一重要钾离子通道BK的功能进行了初步的功能及调控研究。BK钾离子通道的α亚基及其调节亚基β1和β2在哺乳动物细胞系CHO-k1细胞表达并用全细胞模式记录其电流。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 离子通道

1．2 钾离子通道

1．2．1 引言

1．2．2 电压门控钾离子通道

1．2．3 电压门控钾离子通道的辅助亚基

1．3 膜片钳技术

1．3．1 膜片钳技术的简介

1．3．2 膜片钳记录的类型

1．3．3 膜片钳技术的主要应用

1．4 本文主要研究内容

参考文献

第二章 调节亚基KCNE2对KCNQ1通道的作用机制研究

2．1 背景介绍

2．1．1 KCNQ1蛋白

2．1．2 KCNE蛋白家族

2．1．3 KCNE蛋白调控KCNQ1通道功能的研究现状

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料和仪器

2．2．2 质粒构建

2．2．3 细胞培养

2．2．4 细胞转染和滴片

2．2．5 免疫荧光实验

2．2．6 荧光成像

2．2．7 电生理实验

2．2．8 电生理数据分析

2．2．9 分子模拟

2．3 实验结果和讨论

2．3．1 KCNE2的前期实验

2．3．2去污剂中KCNE2的液体核磁共振结构解析

2．3．3 KCNE1和KCNE2的序列及对KCNQ1通道功能比对

2．3．4 KCNEs的C端对KCNQ1通道的调节作用

2．3．5 KCNE1／KCNE2嵌合体对KCNQ1通道的调节特性

2．3．6 KCNE2的N末端对KCNQ1细胞膜表面表达的影响

2．3．7 鉴别KCNE跨膜区(KCNE-TMDs)和KCNQ1的相互作用位点

2．3．8 KCNQ1／KCNE-TMDs的作用模型

2．4 讨论和总结

参考文献

第三章 MPS1的基本结构和功能

3．1 研究背景

3．2 实验方法和结果

3．2．1 MPS-1蛋白的结构预测

3．2．2 MPS-1蛋白的克隆、表达和纯化

3．2．3 MPS-1蛋白剪切突变体的确定及表达纯化

3．2．4 MPS-1蛋白剪切突变体的光谱

3．2．5 Mps-1-123／MPS-1(134-256)蛋白的结构解析

3．2．6 MPS-1(G134-V256)蛋白的二级结构分析

3．2．7 MPS-1(134-256)蛋白的功能检测

3．3 讨论和总结

参考文献

第四章 BK钾离子通道调节亚基的功能初探

4．1 BK钾离子通道的背景知识

4．1．1 引言

4．1．2 BK钾离子通道的结构和辅助亚基

4．1．3 BK钾离子通道的生理机能和功能

4．1．4 BK钾离子通道的门控假说

4．1．5 小结

4．2 实验方法和结果

4．2．1 实验材料和方法

4．2．2 实验思路

4．2．3 BK钾离子通道α亚基单独表达的电生理实验

4．2．4 BK钾离子通道α亚基和β1亚基共表达的电生理实验

4．2．5 BK钾离子通道α亚基和β2亚基共表达的电生理实验

4．2．6 IbTX对BK钾离子通道的抑制作用研究

4．3 总结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果