不同启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影响

摘要

胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。最初的重组表达是通过大肠杆菌分别表达出胰岛素的A链和B链。现在,胰岛素作为重组蛋白产品,主要有两条途径获得。一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体,通过溶解和复性等过程获得胰岛素。另外一条途径是通过酵母表达系统,分泌表达可溶性的胰岛素前体进入培养液。由于对酿酒酵母大规模培养有丰富的经验,使其成为了第一个分泌表达胰岛素前体的酵母系统。虽然酿酒酵母仍然是主要的胰岛素产品表达系统,近些年几个备选的表达系统也提供了可能性。其中,毕赤酵母是一种非常有用并且优势明显的表达宿主。尤其是它强有力的醇氧化酶(Alcoholoxidase,AOX)启动子,受甲醇严格诱导调控,通过简单培养可以达到较高的细胞密度,能够稳定且高水平表达外源蛋白。　　研究目的:构建含短C肽AAK的人胰岛素原类似物DesB30(HMPIDesB30 Human Mini-proinsulin DesB30)的毕赤酵母表达系统,即 pPIC9K- HMPIDesB30/ GS115、pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115、pPIC9K-pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115,通过摇瓶实验筛选出表达量高的工程菌株 FJ-H1、FJ-H2、 FJ-H3。优化发酵条件,考察不同启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影响。　　研究方法:构建重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30和pPIC9K-HMPIDesB30。分别用AvrII酶和SacⅠ酶线性化pGAPZαA-HMPIDesB30和pPIC9K-HMPIDesB30并电转化毕赤酵母菌株 GS115。利用含不同浓度 Zeocin或G418的平板筛选获得多拷贝重组工程菌 pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115和pPIC9K- HMPIDesB30/GS115。将重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30,经AvrII酶单酶切线性化后,电转化至经质粒 pPIC9K- HMPIDesB30异位整合的胰岛素原分泌菌株 pPIC9K-HMPIDesB30/GS115,获得工程菌株pPIC9K-pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115。分别进行摇瓶表达HMPIDesB30并筛选高表达菌株FJ-H1(pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)、FJ-H2(pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115)、 FJ-H3(pPIC9K-pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115),进行发酵工艺的研究。　　研究结果:FJ-H3菌株的表达量最高,可达到1.6 g/L,分别为FJ-H1(1.0 g/L)的1.6倍和FJ-H2(0.3 g/L)的5.3倍。说明应用AOX1和GAP双启动子共表达体系能够提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。将FJ-H3表达的胰岛素前体纯化和酶切回收,通过12％Tricine SDS-PAGE、质谱和肽图分析出HMPIDesB30的分子量与理论分子量相符,FJ-H3表达的目的蛋白均一、正确。　　结论:本研究实现了含短C肽的人胰岛素原类似物HMPIDesB30在毕赤酵母中的高效分泌表达,考察了不同启动子对重组毕赤酵母高密度表达人胰岛素前体的影响。应用AOX1和GAP双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。FJ-H3菌株的表达量最高,可达到1.6 g/L,并且其分泌表达的重组蛋白HMPIDesB30未出现糖基化,未形成二聚体和多聚体,并具有生物学活性。本研究确定了FJ-H3的发酵条件,纯化工艺简单且回收率高,终产品经鉴定正确。

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1 绪 论

1.1 研究意义与背景

1.2 国内外研究现况

1.3 研究目的

1.4 研究内容与技术路线

2 重组质粒构建与鉴定

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.3 两种重组质粒的构建与鉴定

2.4 结果与分析

3 不同启动子重组菌株的转化和筛选

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 重组菌株的转化与筛选

3.4 结果与分析

3.5 小结

4 三株重组菌株的发酵研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 摇瓶培养的研究与结果

4.4 发酵工艺的研究与结果

4.5 小结

5 FJ-H3菌株表达胰岛素前体的纯化及酶切鉴定

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 本研究的创新性

6.3 展望

致谢

参考文献

附录

附图