HB-EGF和谷氨酰胺对坏死性小肠结肠炎新生大鼠线粒体途径细胞凋亡及炎症因子的影响

摘要

研究背景：　　新生儿坏死性小肠结肠炎（Neonatal Necrotizing Enterocolitis，NEC）是新生儿常见的危重症，目前其病因及具体发病机制尚不完全明确。其高危因素包括早产、肠道不成熟、缺氧缺血、人工喂养、细菌移位等。在这些高危因素下，促炎因子释放、肠道炎症级联反应及机体各种调节机制的失衡等综合作用，最终导致NEC的发生发展。NEC病例病情的严重程度不等，有的病例仅为短期的喂养不耐受，而有的则迅速出现小肠、结肠广泛坏死；严重的病例约半数需要手术治疗，并且经手术治疗的病例远期可能存在神经生长发育迟缓等后遗症。因此，临床上采取适当的干预措施来预防NEC的发生具有重要意义。目前，国内外已开展较多这方面的研究，如有研究表明表皮生长因子及谷氨酰胺可预防NEC发生及改善NEC病情；但是现有的研究多限于动物实验，其具体作用机制亦不明确，并且目前暂无充分的统计学上支持的临床使用依据。因此进一步阐明表皮生长因子及谷氨酰胺对损伤肠道保护作用的机制，对防治NEC具有十分重要的意义。　　细胞凋亡在NEC病理生理改变中具有重要的作用。细胞凋亡有两条主要的凋亡转导途径，分别是死亡受体途径和线粒体途径。NEC引起氧化应激时肠道凋亡信号的主要来源是线粒体。线粒体途径有胱解酶（Caspase）依赖性和非依赖性两种方式。在胱解酶依赖性线粒体途径中，细胞色素C由线粒体释放并与凋亡肽酶激活因子（Apoptotic pr otease activating factor1，APAF-1）结合激活胱解酶（Caspase）级联反应是关键步骤；而不依赖Caspase的线粒体途径细胞凋亡机制中，凋亡诱导因子（Apoptosis inducing fact or，AIF），核酸内切酶G（Endonuclease G）等是关键性促凋亡因子。大量研究表明，各种高危因素下，肠道组织细胞的氧化应激、炎症反应及线粒体途径细胞凋亡的活化等共同参与NEC的发生发展，并最终导致肠道损伤。因此，线粒体途径细胞凋亡信号通路可能作为干预靶点或干预措施的效应器而影响NEC的病程。　　肝素结合性表皮生长因子样生长因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）家族成员之一，它通过与表皮生长因子受体（EGF-R）相结合而发挥生物学作用。研究表明，HB-EGF能增加肠道微血管血流，促进血管发生；保护肠道干细胞，促进肠上皮细胞移居及增殖；减少肠道细菌移位，保护肠道屏障功能；下调粘附分子的表达和炎症细胞浸润以及减少肠道细胞凋亡从而起到保护肠道的作用。动物实验表明，EGF和HB-EGF均能显著降低NEC的发生率并改善NEC模型新生大鼠肠道损伤程度。另有研究表明，予IGF-1及EGF干预后，大鼠肠上皮细胞株对活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的凋亡活化信号减弱；而在人类胎儿肠上皮细胞株中，联合予 IGF-1及 EGF可减弱线粒体途径细胞凋亡信号而具有抗凋亡作用。因此，HB-EGF亦有可能通过调节线粒体途径细胞凋亡通路而在肠上皮细胞的损伤修复中发挥重要作用。　　谷氨酰胺（glutamine，Gln）是人体内含量最多的条件必须氨基酸，是一种高效能量物质，为体内合成嘌呤、嘧啶及核苷酸提供氮的前体，参与体内酸碱平衡调节，运送氮源，也是氮源的提供体，是肠道粘膜细胞及各种快速生长细胞（如肾小管细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞）的代谢氧化燃料，被称为组织特需营养物。与肝脏或骨骼肌相比，肠上皮细胞内Gln池储量很小，明显依赖于外源性Gln的供给。在疾病、营养状态不佳或高强度运动等应激状态下，Gln可以通过降低肠粘膜通透性和减少菌群移位来增强肠道免疫力、阻止肠粘膜细胞凋亡等而起到保护肠道的作用。　　另外，炎症级联反应是NEC病理生理改变的核心环节，研究表明，NEC病程中升高的炎症因子、促炎因子和抗炎因子的失衡在 NEC中发挥重要作用。动物实验表明，在新生大鼠NEC中，促炎因子IL-12、IL-18与组织损害严重程度成正相关。　　鉴于此，我们推测，HB-EGF和Gln可能影响线粒体途径细胞凋亡通路，改善NEC模型新生大鼠损伤肠道的形态学及降低炎症水平，从而降低NEC发生率、改善NEC病程及预后。但是HB-EGF和谷氨酰胺在线粒体途径细胞凋亡中的作用国内外鲜有报道。本实验拟通过建立NEC新生大鼠模型，予HB-EGF和Gln干预，观察肠道损伤的变化、检测线粒体途径细胞凋亡通路相关因子及相关促炎因子，以进一步阐明HB-EGF和Gln对NEC模型新生大鼠肠道损伤保护作用的机制。　　目的：　　1.建立新生大鼠 NEC模型，探讨HB-EGF在坏死性小肠结肠炎线粒体途径细胞凋亡中的作用，为HB-EGF在NEC中的抗凋亡作用机制提供理论和实验依据。　　2.探讨谷氨酰胺在坏死性小肠结肠炎线粒体途径细胞凋亡中的作用，为谷氨酰胺抗肠道细胞凋亡的作用机制提供理论依据。　　3.测定NEC新生大鼠回肠中IL-12及IL-18蛋白的表达，进一步阐述谷氨酰胺、HB-EGF对NEC新生大鼠促炎症因子的影响。　　方法：　　1.新生大鼠NEC模型的建立：乳鼠娩出后即与母鼠分离，生后即开始代乳品人工喂养；并每天予缺氧90秒、4℃冷刺激10min，每天2次，连续3天。　　2.实验分组：新生大鼠随机分为A、B、C、D四组，每组各10只。A组（模型组）：予代乳品人工喂养，并定期给予缺氧冷刺激；B组（HB-EGF干预组）：予代乳品人工喂养，定期给予缺氧冷刺激，并予HB-EGF与配方奶一起灌胃，800μg/kg/次，每天4次，连续3天；C组（对照组）：予鼠乳喂养；D组（Glu干预组）：代乳品人工喂养，定期给予缺氧冷刺激，并予谷氨酰胺与配方奶一起灌胃，0.3g/次，每天6次，连续3天。　　3.干预结束后12h（对照组与模型组于相应时间点）取回肠组织，光镜观察各组病理改变；电镜观察回肠组织肠上皮与肌层细胞线粒体改变。　　4.免疫组织化学方法检测细胞色素C　　5. Western-Blot检测线粒体凋亡通路中AIF、APAF-1表达情况。　　6. ELISA法检测回肠组织匀浆上清中IL-12、IL-18水平，观察各组炎症反应情况。　　7.采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x s±）表示。计数资料以率表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义　　结果：　　1.HB-EGF在新生鼠NEC线粒体途径细胞凋亡中的作用　　1.1 NEC模型组（A组）NEC发生率为90％。HB-EGF干预组（B组）NEC发生率为20%。正常对照组（C组）NEC发生率为0。NEC发生率A组与C组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组与B组比较，差异亦具有统计学意义（P＜0.05）。　　1.2电镜下 A组回肠肠上皮细胞及肌层细胞中线粒体明显肿胀，基质内有多数电子透亮区；C组中线粒体超微结构正常；B组中有少量线粒体肿胀，较之A组病变明显减轻。　　1.3细胞色素C的表达A组与C组比较，差异具有统计学意义，前者高于后者（P＜0.05）。细胞色素C在B组中亦有大量表达，B组与A组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。　　1.4 APAF-1、AIF的表达A组与C组比较，前者高于后者。与A组相比，B组APAF-1的表达减低，AIF的表达则明显增强。　　2.谷氨酰胺在新生鼠NEC线粒体凋亡中的作用　　2.1谷氨酰胺干预组（D组）NEC发生率为40%。NEC发生率D组与A组比较，差异有统计学意义，D组低于A组（P＜0.05）。　　2.2电镜下D组回肠上皮及肌层中有少量线粒体肿胀，较之A组病变明显减轻。　　2.3细胞色素C的表达D组与A组比较，差异有统计学意义，D组较A组减弱（P＜0.05）。　　2.4与A组比较，D组APAF-1的表达减弱，AIF的表达增强。　　3.HB-EGF和谷氨酰胺在新生鼠NEC中对IL-12和IL-18的影响　　3.1与C组相比，回肠组织IL-12水平在A组明显增加；B组和D组分别与A组比较，IL-12表达水平均减低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。　　3.2与C组相比，回肠组织IL-18在A组明显增加；B组和D组分别与A组比较，IL-18表达水平均减低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　1. HB-EGF可减少NEC模型新生大鼠肠道细胞凋亡，但仅能抑制部分凋亡蛋白因子，该作用可能是通过调节线粒体途径细胞凋亡因子而间接干预线粒体途径细胞凋亡通路而实现的。　　2.谷氨酰胺可能通过抑制线粒体途径细胞凋亡通路对NEC模型新生大鼠肠道具有保护作用。　　3. HB-EGF和谷氨酰胺均能通过抑制促炎症因子IL-12、IL-18的表达从而减轻NEC模型新生大鼠的肠道损伤。

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中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分 HB-EGF对坏死性小肠结肠炎新生大鼠线粒体途径细胞凋亡的作用

材料与方法

1. 材料

2 实验方法

结 果

1 一般状态及生长情况

2. 各组NEC发生率及肠组织病理改变

3. 电镜下线粒体超微结构变化

4. 免疫组织化学方法测定细胞色素C含量

5. Western印迹方法检测回肠组织中APAF-1及AIF的蛋白表达水平

讨 论

结 论

第二部分 谷氨酰胺在坏死性小肠结肠炎线粒体途径细胞凋亡中的作用

材料与方法

1.材料

2.方法

结 果

1. 一般状态及生长情况

2. 各组NEC发生率及肠组织病理改变

3.电镜下线粒体超微结构变化（图2-3）

4. 免疫组织化学方法测定细胞色素C含量

5. Western印迹方法检测各组回肠组织中APAF-1及AIF的蛋白表达水平

讨 论

结 论

第三部分 HB-EGF和谷氨酰胺对NEC中炎症因子IL-12和IL-18的影响

实验材料与方法

1. 材料

2．方法

3．统计学分析

结 果

讨 论

结 论

参考文献

综 述

致谢

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