肠道菌群通过TLRs减轻电离辐射诱发DNA损伤的机制研究

摘要

一般认为,肠道内源性菌群与宿主存在共生关系,肠道内源性菌群参与宿主的营养和能量平衡,对宿主免疫系统的进化和功能的维持发挥着积极的作用。反过来,宿主为微生物提供一个能够维持其生存的环境,从这个环境中微生物能够获得其必须的营养物质,保证其在宿主不同个体间的传播和隐匿。已有研究表明,肠道内源性菌群可以通过其组份激活Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),减轻硫酸葡聚糖钠(dextran sulfate sodium,DSS)对肠道粘膜造成的损伤,维持肠道的自稳平衡。文献报道发现,TLR4和TLR5受体激活具有防护电离辐射损伤作用。TLRs的配体来源主要为细菌的不同组分。作为电离辐射的特异性损伤之一, DNA损伤的修复在正常机体生命活动中处于一种动态变化过程。肠道菌群作为机体的共生物,伴随生命的进程。本研究利用电离辐射诱发小鼠造血细胞DNA损伤为研究模型,探索肠道菌群中TLRs家族对DNA损伤和修复过程的影响和相关分子机制。
　　首先,利用广谱抗生素清除小鼠肠道内源性共生菌群,而后对小鼠进行2Gyγ射线照射,与单纯照射小鼠相比,肠道菌群清除后进行照射的小鼠骨髓细胞染色体畸变率明显增加;外周血细胞彗星电泳实验显示,反映 DNA损伤的彗星尾距明显增加,表明清除肠道菌群可以促进电离辐射导致的DNA损伤。为了进一步分析肠道菌群对DNA损伤的防护作用是否与TLRs受体相关,我们分析了肠道菌群清除小鼠血清中 TLRs配体的变化。通过 Elisa方法对肠道菌群清除小鼠体内的TLRs含量进行检测,发现血清中三种 TLRs(TLR2/6、TLR4和 TLR5)的配体Lipopeptede、LPS和Flagellin均有不同程度的下降,因此推测:TLRs配体的减少及由此而导致TLRs功能激活的减弱可能是导致其DNA损伤增加的直接原因。为了确定这些来源于细菌组份的 TLRs配体是否具有减轻辐射诱发 DNA损伤的作用,我们将这些配体分别回转正常小鼠和肠道内源性菌群清除小鼠,分别用CBLB502(Flagellin的功能同源物)、LPS、Lipopeptide激活TLR5、TLR4和TLR2/6后,发现能够明显减轻电离辐射诱发的DNA损伤(骨髓细胞染色体畸变率降低,外周血细胞彗星电泳彗星尾距缩短)。上述研究表明,肠道菌群通过激活TLRs家族(TLR2/6、TLR4和TLR5),减轻电离辐射诱发的小鼠造血细胞DNA损伤。
　　为了进一步探索肠道菌群通过 TLRs受体激活调节电离辐射诱发造血细胞DNA损伤的分子机制,采用基因芯片方法筛选TLR5激活后骨髓细胞基因表达谱的变化情况。结果表明,与对照组相比,TLR5激活后,骨髓细胞中共有85个基因表达上调,2个基因表达下调。进一步挑选出4个参与 DNA损伤修复的基因Apex2、Gadd45β、Sod2和Rad21,用Real Time-PCR方法对TLR5、TLR4和TLR2/6激活后4种基因的表达进行了验证,发现这些基因的表达均有不同程度的上调。对肠道菌群清除小鼠骨髓细胞分析发现,上述4个基因表达均出现明显下调。
　　本研究发现,肠道内源性菌群可以通过其组份激活 TLRs家族,通过调节Apex2、Gadd45β、Sod2和Rad21等DNA损伤修复相关基因的表达,减轻电离辐射诱发的造血细胞DNA损伤。提示肠道内源性共生菌群通过其组份对TLRs的识别和激活,或参与稳态下机体自身的 DNA损伤修复过程,从而降低宿主由 DNA损伤所导致的癌症等疾病风险。

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引言

第一部分 清除肠道共生菌群促进电离辐射诱发小鼠造血细胞DNA损伤

1 材料与方法

1.1材料

1.2 照射条件

1.3 方法

1.4 数据处理

2 结果

2.1 肠道菌群清除效果鉴定

2.2电离辐射对肠道菌群清除小鼠骨髓细胞染色体畸变影响

2.3 肠道菌群清除对小鼠外周血细胞DNA损伤的影响

2.4 肠道菌清除后小鼠血清中Flagellin、LPS和Lipopeptide水平变化。

3、小结

第二部分 激活TLRs受体减轻电离辐射诱发小鼠造血细胞DNA损伤

1 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2 结果

2.1 TLRs信号通路激活减少电离辐射诱发的小鼠骨髓细胞染色体畸变率

2.2 TLRs信号通路激活对电离辐射诱发的小鼠外周血细胞DNA损伤的影响

2.3 TLRs信号通路激活对电离辐射诱发小鼠骨髓细胞γ-H2AX Foci数量的影响

2.4 TLRs配体激活降低电离辐射诱发肠道菌群清除小鼠骨髓细胞染色体畸变

2.5 TLRs配体减轻电离辐射诱发肠道菌群清除小鼠外周血细胞DNA损伤

3、小结

第三部分 肠道菌群减轻电离辐射诱发DNA损伤的分子机制研究

1 材料与方法

2 结果

3、小结

讨论

总结

参考文献

附 录 I

附 录 Ⅱ

附 录 Ⅲ

综述

致谢