含纳米/亚微米柞蚕丝素纤维的三维支架制备及特性

摘要

丝素多孔材料用作皮肤真皮再生支架时，需要进一步解决的问题是如何促进丝素支架内毛细血管和微血管网络的形成，提高其移植到真皮缺损伤面后的成活率。利用纳米／亚微米纤维对细胞的接触引导作用，赋予支架类似天然细胞外基质的纳米／亚微米孔壁，以及相互连通的孔结构，为血管内皮细胞的粘附、迁移和生长提供物理刺激信号和微环境，是提高组织工程支架血管化速度的可行途径。本文采用高压静电纺丝技术，以六氟异丙醇为溶剂，制备柞蚕丝素纳米／亚微米纤维，再利用冷冻干燥法制备含纳米／亚微米柞蚕丝素纤维的丝素支架，这一支架不仅含有柞蚕丝素天然的RGD三肽序列，携带了刺激血管内皮细胞粘附和生长的化学信号；而且孔壁上含纳米／亚微米丝素纤维，孔之间具有更好的连通性，携带了刺激血管内皮细胞迁移和生长的物理信号。本文研究家蚕丝素支架内柞蚕丝素纳米／亚微米纤维的含量和长度对支架结构的影响，并通过在支架内接种和体外培养人脐静脉血管内皮细胞EA.hy926，研究三维支架内纤维含量对细胞生长的影响。　　首先，采用高压静电纺丝技术，以六氟异丙醇为溶剂，纺制柞蚕丝素纳米／亚微米纤维，研究高压静电纺丝过程中纺丝液浓度、静电电压和接收距离对纺制的柞蚕丝素纳米／亚微米纤维直径的影响。结果表明：以HFIP为溶剂溶解柞蚕丝素进行静电纺丝，固定溶液推注速度、针头大小、静电电压和接收距离不变，当纺丝液浓度从7%增大到g%时，静电纺丝得到的柞蚕丝素纤维的直径增大。固定溶液推注速度、针头大小、纺丝液浓度和接收距离不变，当静电电压为12 kV时，静电纺得的柞蚕丝素纤维的平均直径较静电电压为8 kV或16 kV时小。固定溶液推注速度、针头大小、静电电压和纺丝液浓度不变，当接收距离分别为7、10和13 cm时，接收距离较大者，制得的柞蚕丝素纤维的平均直径较大。　　其次，分别采用流延法和冷冻干燥法制备含柞蚕丝素纤维的丝素膜和多孔丝素材料，研究柞蚕丝素纤维的含量和长度对丝素膜和多孔丝素材料结构及性能的影响。研究结果表明：丝素膜中柞蚕丝素纤维的含量占3～20%时，对丝素膜拉伸断裂强度和杨氏模量的提高有作用，大于20%时，造成丝素膜强度、伸长及杨氏模量的下降。丝素膜中柞蚕丝素纤维的长度对膜的强度、伸长及杨氏模量无明显影响。多孔丝素材料中柞蚕丝素纤维的含量在50%以上时，孔壁上微孔数量明显增多，孔与孔之间的连通性明显提高；当柞蚕丝素纤维含量增大至100%以上时，部分孔壁基本都由柞蚕丝素纤维组成，孔壁上的微孔数量更多，孔与孔之间的连通性有更显著的提高。多孔丝素材料中柞蚕丝素纤维的长度对孔结构无明显影响。经聚乙二醇缩水甘油醚交联后，丝素膜及多孔材料的聚集态结构发生了无定型Silk Ⅰ结构向Silk Ⅱ结构的转变。材料内丝素纤维含量为5%时，未显示出对丝素膜及多孔材料产生可检测到的聚集态结构改变。　　最后，通过体外细胞培养，研究了柞蚕丝素纤维含量为0、50、150、250%的三维支架对EA.hy926细胞黏附和生长的影响。用激光共聚焦和阿尔玛蓝法对含柞蚕丝素纤维的三维支架的细胞相容性进行检测和分析，结果表明，EA.hy926细胞在含柞蚕丝素纤维的三维支架上能够『F常黏附、增殖和生长，且形态正常，随着培养时间的延长细胞数量逐渐增多。EA.hy926细胞在柞蚕丝素纤维含量为150%的多孔材料上的增殖能力高于其他柞蚕丝素纤维含量的多孔材料。　　本文分别采用流延法和冷冻干燥法制备含纳米／亚微米柞蚕丝素纤维的丝素膜和多孔丝素材料，研究了纳米／亚微米柞蚕丝素纤维的含量和长度对丝素膜和多孔丝素材料结构及性能的影响；通过体外细胞培养，研究了含纳米／亚微米柞蚕丝素纤维的三维支架对EA.hy926细胞黏附和生长的影响。含纳米／亚微米柞蚕丝素纤维的三维支架能够更好地支持人脐静脉血管内皮细胞EA.hy926的黏附、增殖和生长，这将能作为一种新型再生支架用于促进真皮再生过程中的血管化。

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