穿膜肽/NF-κB拮抗多肽原核表达载体的构建、表达、纯化与功能检测

摘要

核因子-κB(NF-κB)是一种普遍存在的转录因子，它在免疫应答、炎症反应、病毒复制、细胞凋亡和增殖等多种细胞活动中起关键的作用。NF-κB可高效诱导6多种细胞因子、粘附分子、趋化因子和急性期反应蛋白的基因表达，同时对参与炎症反应放大与延续的多种酶的基因表达也具有重要的调控作用。此外，NF-κB的过度活化与肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎症相关性疾病、某些神经性疾病、变态反应以及机体对移植物的排异反应等疾病的发生、发展均密切相关。因此，有学者最近提出NF-κB是极具潜力的新型抗炎靶点。从理论上讲，如能有效拮抗NF-κB的活化，则可达到一定程度地缓解或治疗炎性相关疾病的目的。 本研究在利用NF-κB与DNA顺式元件相结合这一特异性环节为突破口，以p65亚基的DNA结合域和p50的保守结构域为“诱饵”，从一16肽随机肽库中筛选出5条与NF-κBp65亚基的DNA结合域结合的多肽，9条与p50保守结构域结合的多肽。但是，通过多肽序列分析发现，获得的14条多肽疏水性较强，直接应用多肽合成仪合成的产物水溶性差。 为了获得特异性地与NF-κB相互作用的可溶性多肽，需要进行基因重组，通过大肠杆菌进行表达和纯化，本研究进行了以下工作： 1.pET42a/P/GST融合蛋白原核表达质粒的构建。通过NcoⅠ和BamHⅠ双酶切作用，将穿膜肽序列插入到pET42a中，与GST序列形成融合蛋白。酶切鉴定、DNA测序结果表明，重组质粒中多肽cDNA碱基序列正确，阅读框没有发生移码，质粒重组成功，命名为pET42a/P/GST。 2.pET42a/PP/GST蛋白融合蛋白原核表达质粒的构建。采用PCR技术扩增多肽cDNA，并将其构建到上述原核表达载体质粒中，构成与GST融合基因，PCR及酶切鉴定正确，DNA测序结果表明，重组质粒中多肽cDNA碱基序列和阅读框均正确，重组质粒成功，命名为pET42a/PP/GST。 3.穿膜肽/多肽/GST融合蛋白的原核表达。将重组质粒pET42a/PP/GST转化入蛋白酶缺陷的大肠杆菌BL-21(DE3)中，用IPTG为诱导剂，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。经过实验发现，该多肽在YT培养基，IPTG浓度为0.25mmol/L，温度为34℃，pH7.2，诱导时间为5hr，可溶的PP/GST融合蛋白表达量可达细胞总蛋白的28％。 4.穿膜肽/多肽/GST融合蛋白纯化和GST标签切除在最佳条件下诱导表达，离心收集菌体，经溶菌酶消化、超声破碎，离心收集上清液，利用镍柱特异性结合目标蛋白质C末端的一段连续六个His残基吸附作用，将目标蛋白吸附在滤膜上，以除去杂蛋白。镍柱用洗涤液洗涤三次后，用Xa因子工作液直接上柱洗脱，收集的洗脱液即为切除GST的重组穿膜肽/多肽融合蛋白质溶液。 5.穿膜肽/多肽融合蛋白活性检测将纯化后的蛋白质送交北京塞百盛公司进行末端荧光标记。标记好的蛋白质配制成10mg/L的溶液，按一定浓度梯度加入培养基中培养U973和HEK293细胞。观察发现，穿膜肽/多肽融合蛋白最快只需30min便能穿过细胞膜进入细胞。该实验证明通过本实验得到的蛋白质具有很高的活性。

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文摘

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文献综述

1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

致谢

参考文献

作者简介及攻读硕士期间发表文章