体外软骨内骨化Cox-2与Col10a1基因表达及软骨细胞肥大成熟的相关性研究

摘要

第一部分：RUNX2与骨肉瘤（综述）　　骨肉瘤是在儿童和年轻人中最常见的恶性骨肿瘤，之前已有研究表明了成骨细胞的活性对骨肉瘤的肿瘤形成与远处转移的重要性[99,100]。骨肉瘤以异常的骨骼形成为特征，成骨细胞在骨肉瘤及其转移性的肿瘤组织中是主要的细胞类型。众所周知，RUN X2是成骨细胞分化必不可少的转录因子，RUNX2基因可能与骨肉瘤的发病机制有关，它通过调控骨母细胞的细胞周期，使骨母细胞转变成骨肉瘤细胞。RUN X2与人类的许多(骨)肿瘤和肿瘤的骨转移有关。我们讨论了利用人骨肉瘤细胞系异种移植和肿瘤抑制基因p53和Rb1建立起来的多种小鼠骨肉瘤模型中Runx2基因的潜在效应。最后我们更新了一些microRNA的研究以及它们在骨肉瘤的发病中与RUNX2的关联。　　第二部分：体外软骨内骨化Cox-2与Col10a1基因表达及软骨细胞肥大成熟的相关性研究　　研究背景：　　在肥大型软骨细胞中，十型胶原蛋白基因（Col10a1）特异性高表达。Col10a1基因变异或异常表达通常都伴发异常的软骨成熟或肥大从而导致多种骨骼疾病。本实验室此前的研究表明，Runx2是介导小鼠Col10a1基因特异表达的必需转录因子。我们最近的研究发现还有多种潜在的Col10a1基因调节因子，其中包括环氧化酶2（Cox-2）。我们推测Cox-2可能在体外通过上调软骨细胞成熟分化相关的标志基因，如Runx2等，从而增强Col10a1基因的表达以及促进软骨细胞肥大成熟。　　研究目的：　　利用不同的小鼠软骨细胞模型，探讨Cox-2影响Col10a1基因表达及软骨细胞发育成熟的体外功能。　　研究方法：　　（1）应用荧光定量PCR技术检测Cox-2和Col10a1基因在小鼠MCT细胞和ATDC5细胞中的表达。MCT细胞和ATDC5细胞根据培养条件的不同分为增殖型和肥大型软骨细胞。肥大型软骨细胞中Cox-2和Col10a1基因的表达明显升高。　　（2）应用基因转染和药物干预技术，在MCT细胞和ATDC5细胞中过表达或抑制Cox-2的表达，以研究其对Col10a1基因表达、软骨细胞分化成熟及其相关标志基因的调控作用。　　研究结果：　　（1）荧光定量PCR技术检测结果表明：和增殖型软骨细胞比较，Cox-2在MCT和ATDC5两种肥大型软骨细胞的表达都显著升高。其结果与 Col10a1基因的表达水平呈正相关。　　（2）我们在MCT细胞和ATDC5细胞中抑制Cox-2的表达，结果导致Col10a1的mRNA和蛋白水平均显著降低，而过表达Cox-2则显著提高Col10a1的表达，表明Cox-2对于Col10a1的正向调控作用。基因表达分析和碱性磷酸酶等细胞染色结果表明Cox-2促进软骨细胞的肥大成熟分化，可能与其上调Runx2等其它与软骨成熟相关的标志基因的表达相关。　　研究结论：　　Cox-2与两种软骨细胞模型中Col10a1基因的高表达呈正相关。Cox-2促进软骨细胞肥大与成熟分化。Cox-2可能与Runx2等多种转录因子一起构成调节Col10a1基因表达的新型机制进而影响骨骼发育与疾病中软骨细胞成熟的进程。

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主要英文缩略词索引

第一部分 综述:RUNX2与骨肉瘤

1.1摘 要

1.2骨肉瘤与成骨细胞活性

1.3 RUNX2是人类骨肉瘤的靶基因

1.4 RUNX2在骨肉瘤发病中的潜在机制

1.5 RUNX2在骨肉瘤远处转移及其他相关癌症骨转移中的作用

1.6 microRNA与 RUNX2及骨肉瘤发病机制的关联

1.7小结

第二部分 体外软骨内骨化Cox-2与Col10a1基因表达及软骨细胞肥大成熟的相关性研究

2.1摘要

2.2 ABSTRACT

2.3绪论

2.3.1软骨细胞肥大与Col10a1基因异常表达的相关研究

2.3.2 COX-2和十型胶原蛋白基因

2.3.3 RUNX2、COX-2与COL10A1基因调节

2.4材料

2.4.1主要试剂

2.4.2主要溶剂配制

2.4.3主要仪器

2.4.4研究对象

2.5方法

2.5.1引物设计

2.5.2 MCT与ATDC5细胞株的培养

2.5.3 MCT、ATDC5细胞诱导分化

2.5.4细胞RNA提取

2.5.5 DNA酶处理

2.5.6逆转录

2.5.7荧光定量PCR

2.5.8 MCT、ATDC5细胞株的NS398药物筛选

2.5.9蛋白提取步骤

2.5.10 Western Blot实验步骤

2.5.11 SSCS高效感受态细胞制备方法(大肠杆菌)

2.5.12目的载体pCM V6-Cox-2质粒的扩增

2.5.13空载体pCM V6质粒的构建

2.5.14空载体质粒与目的载体质粒的鉴定

2.5.15 ATDC5细胞G418药物筛选

2.5.16细胞转染（转染pCM V6-Cox-2质粒及空载pCM V6质粒）

2.6结果

2.6.1 Col10a1与Cox-2基因在两个肥大型软骨细胞模型中表达增加

2.6.2在两个软骨细胞模型中NS398药物的筛选及抑制效应

2.6.3空载体与目的质粒的酶切鉴定

2.6.4 ATDC5细胞中过表达Cox-2基因对Col10a1的影响

2.6.5 Cox-2稳转细胞系中其它标志基因的表达分析

2.6.6阿尔新蓝染色，碱性磷酸酶染色，茜素红染色

2.7讨论

2.7.1 Cox-2与Col10a1基因的相关性以及对软骨细胞肥大分化的影响

2.7.2 Cox-2基因在软骨内成骨过程中潜在的作用机制

2.8主要结论与展望

主要结论

展望

参考文献

致谢

研究生期间发表论文