StGAPC和StEnolase在马铃薯块茎低温贮藏过程中的作用

摘要

为了延长马铃薯的加工周期，减少贮藏期间原料损失，收获后的马铃薯一般采用低温贮藏，但低温贮藏会引起块茎低温糖化，这严重影响了马铃薯加工品质。本研究中，从抗低温糖化马铃薯材料S.berthaultii中克隆了两个在低温贮藏期间均上调表达的基因StGAPC和StEnolase，并通过反向遗传学方法分析了这两个基因对马铃薯块茎的淀粉-糖代谢的影响，从而推测其在块茎低温糖化中的作用。主要结果如下:　　 1.通过RT-PCR方法扩增获得了两个候选基因(StGAPC，StEnolase)的全长ORF，分别为1015bp和1335bp，分别编码338个和444个氨基酸，比对分析结果表明，它们分别为糖酵解途径上的磷酸化胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶和烯醇化酶基因。这两个基因在马铃薯植株中均为组成型表达，不具有器官特异性，但都在块茎贮藏期间受到低温诱导而上调表达，说明它们参与马铃薯对低温的响应。亚细胞定位结果显示，StGAPC基因主要定位在细胞质中，而StEnolase基因主要在细胞膜上。　　 2.干涉或超量StGAPC的表达对植株的田间生长表型无明显影响，但转StGAPC干涉株系块茎休眠期明显缩短，且块茎萌发时的顶端优势消失，块茎顶端出现多个芽同时萌发的现象。基因表达、酶活性和还原糖含量测定结果表明，抑制表达StGAPC，能够显著降低GAPDH酶活性，一定程度上加强块茎呼吸速率，提高低温贮藏转基因块茎中的还原糖积累;而超量表达StGAPC，能够降低转基因块茎中还原糖含量，部分株系块茎还原糖含量低于对照近50％。相关代谢物质含量测定结果表明，抑制表达StGAPC，GAPDH酶下游产物3-PGA的含量明显降低，糖酵解和TCA过程中相关代谢物质发生明显变化，由此可以推测，由于StGAPC基因表达的变化，使得TCA和PPP途径发生改变，从而影响了贮藏期间块茎的呼吸强度和还原糖含量，进而在一定程度上调控了块茎的低温糖化，这个推测以及块茎休眠期的缩短和发芽顶端优势的解除的原因还需进一步研究证实。　　 3.通过调节不同材料中StEnolase的表达发现，超量转基因株系田间生长表型与对照无明显差异，而干涉转基因株系出现叶片发黄、植株生长缓慢和植株产量明显下降现象，其叶片叶绿素、还原糖和蔗糖均显著低于对照，说明对StEnolase的抑制表达能够减弱植株光合作用进而影响植株生长发育。后续试验结果表明，转基因干涉株系块茎中Enolase酶活性明显下降，其催化产物PEP含量明显降低，且低温贮藏时累积的葡萄糖、果糖和蔗糖含量均显著高于对照，而转基因超量株系块茎可能因为超量表达效果不高或其他原因，其低温贮藏过程中还原糖的积累速率与对照相比不显著;转基因干涉株系块茎中磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)及芳香族氨基酸的含量均显著低于对照，苹果酸含量、6-磷酸-蔗糖和6-磷酸-海藻糖含量则均显著高于对照。说明糖酵解途径上的StEnolase一定程度上调控了块茎低温糖化，而且能够影响转基因株系芳香族氨基酸的合成。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题提出

1．2 文献综述

1．2．1 马铃薯块茎低温糖化现象及其机理

1．2．2 马铃薯块茎低温糖化研究及改良策略

1．2．3 糖酵解途径上甘油醛-3-磷酸脱氢酶和烯醇化酶研究进展

1．3 研究内容与目的

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株、质粒及引物

2．2 实验方法

2．2．1 马铃薯核酸与总蛋白的提取

2．2．2 cDNA的制备、基因克隆及qPCR分析

2．2．3 质粒抽提与载体构建

2．2．4 农杆菌介导的马铃薯遗传转化与转基因植株筛选

2．2．5 基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达与荧光成像

2．2．6 马铃薯生理生化指标测定

3 StGAPC基因结果与分析

3．1 StGAPC基因的克隆与分析

3．2 StGAPC基因马铃薯组织特异性与在块茎贮藏中的表达分析

3．2．1 StGAPC基因的马铃薯组织特异性分析

3．2．2 StGAPC基因的马铃薯块茎贮藏中的基因表达分析

3．3 StGAPC基因的洋葱表皮亚细胞定位

3．3．1 StGAPC基因与GFP融合表达载体的构建

3．3．2 pFF19-GFP-StGAPC亚细胞定位

3．4 StGAPC基因在马铃薯低温糖化中的作用

3．4．1 StGAPC基因干涉表达载体和超量表达载体构建

3．4．2 马铃薯遗传转化及StGAPC转基因株系的获得

3．4．3 StGAPC转基因株系的筛选

3．4．4 StGAPC转基因株系的田间种植表型

3．4．5 StGAPC转基因干涉株系块茎低温贮藏实验结果

3．4．6 StGAPC转基因超量株系块茎低温贮藏实验结果分析

3．4．7 StGAPC转基因干涉株系块茎低温贮藏期间代谢组分分析

3．5 StGAPC讨论

3．5．1 抑制StGAPC的表达不影响植株正常生长但缩短块茎休眠期

3．5．2 StGAPC可能通过调节糖酵解途径调控了马铃薯块茎低温糖化

3．5．3 研究展望

4 StEnolase基因结果与分析

4．1 StEnolase基因的克隆与分析

4．2 StEnolase基因组织特异性分析与块茎贮藏中的表达分析

4．2．1 StEnolase基因在马铃薯中组织特异性表达分析

4．2．2 StEnolase基因在不同低温糖化抗性块茎贮藏过程中的表达分析

4．3 StEnolase基因洋葱表皮亚细胞定位

4．3．1 StEnolase基因与GFP融合表达载体构建

4．3．2 pFF19-GFP-StEnolase亚细胞定位

4．4 StEnolase基因在马铃薯低温糖化中的作用

4．4．1 StEnolase基因干涉表达载体和超量表达载体构建

4．4．2 马铃薯遗传转化及StEnolase转基因株系的获得

4．4．3 StEnolase转基因株系的筛选

4．4．4 StEnolase转基因株系田间种植表型及叶片生理生化指标测定

4．4．5 StEnolase转基因干涉株系块茎低温贮藏实验

4．4．6 StEnolase转基因超量株系块茎低温贮藏实验

4．4．7 StEnolase转基因干涉株系低温贮藏块茎代谢组分分析

4．5 StEnolase结果讨论

4．5．1 对StEnolase的抑制表达能够强烈影响马铃薯的生长发育

4．5．2 StEnolase能一定程度上影响马铃薯块茎的低温糖化

4．5．3研究展望

参考文献

附录

附录1 StGAPC核苷酸序列

附录2 StEnolase核苷酸序列

致谢