内质网应激蛋白在Cyp4a14基因敲除小鼠肠炎模型中的表达及意义

摘要

背景：炎症性肠病（inflammatoryboweldisease,IBD）是一种肠道的慢性非特异性炎症性疾病，其病因还未明确。内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）参与多种疾病的发病机制，包括IBD。Cyp4a14是一种肝脏产生的与脂质过氧化及氧化应激密切相关的酶。然而Cyp4a14基因对炎症性肠病ERS影响仍不清楚。　　目的：探究ERS相关蛋白在葡聚糖硫酸钠（dextrasulfatesodium,DSS）诱导的Cyp4a14基因敲除小鼠肠炎模型中的表达及意义。　　方法：选取6-8周龄，体重为19-25g，健康清洁级129S1/SvJ种系Cyp4a14基因敲除（knockout,KO）和野生型（wildtype,WT）雄性小鼠，随机分为WT对照组、WTDSS组、KO对照组和KODSS组，每组8只，4只每笼，并适应性喂养1周，确认小鼠健康且适应环境。对照组自由饮用双蒸水，DSS组则饮用3.0%DSS溶液。造模周期为6天，第6天造模结束后终止所有干预措施。通过体重变化情况、疾病活动指数评分（diseaseactivityindex,DAI）、结肠长度和HE染色等方法以及白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）-αmRNA水平评估肠道炎症程度，采用实时定量PCR技术检测小鼠结肠组织内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1α、XBP1u、XBP1s、IRE1β、PERK、ATF6和CHOP，及肝脏Cyp4a14mRNA的表达水平，采用免疫组化及westernblot法检测小鼠结肠组织GRP78、ATF6和CHOP蛋白的表达情况，采用westernblot法检测小鼠肝脏Cyp4a14蛋白表达情况。　　结果：　　1.WT和KO对照组均无肠炎表现，而KODSS组有轻度肠炎、WTDSS组有重度肠炎。WT和KODSS组组织病理学评分及DAI评分与对照组相比均显著增高（均P＜0.05），且WTDSS组与KODSS组相比升高更为明显（P＜0.05）；WTDSS组结肠长度明显缩短（均P＜0.05）；　　2.炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平在WTDSS组与KODSS组表达明显升高（均P＜0.05），且IL-6和TNF-αmRNA在WTDSS组比KODSS组升高更为显著（P＜0.05）。　　3.炎症组与对照组比较IRE1α、XBP1u和PERKmRNA表达无差异；IRE1βmRNA在WT和KODSS组表达明显下调（均P＜0.05）；XBP1s在WTDSS组与WT对照组相比表达降低（P＜0.05），而ATF6和CHOPmRNA表达升高（均P＜0.05），但KODSS组与KO对照组相比无差异。　　4.Cyp4a14mRNA及蛋白在WTDSS组肝脏表达明显下调（均P＜0.05）。　　5.WTDSS组GRP78、ATF6和CHOPmRNA及蛋白与WT对照组比较明显升高（均P＜0.05）。　　结论：　　1.Cyp4a14基因敲除小鼠可以抵抗DSS诱导的肠炎。　　2.Cyp4a14基因可能通过影响ATF6、CHOP和XBP1smRNA的表达参与ERS的调控，从而在IBD的病理过程中发挥重要作用。　　3.GRP78-ATF6-CHOP通路在小鼠结肠炎模型中被激活，可能参与了IBD的发展过程。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 炎症性肠病概述

1.1.2 内质网应激概述

1.1.3 Cyp4a14概述

1.1.4 炎症性肠病与内质网应激概述

1.2 研究目的

1.3 研究意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 试剂的配置

2.2 实验方法

2.2.1 小鼠基因型的鉴定

2.2.2 小鼠结肠炎模型的建立

2.2.3 小鼠组织取材

2.2.4 观察指标

2.2.5 HE染色及组织病理学评分

2.2.6 免疫组织化学染色及结果判定标准

2.2.7 总mRNA的提取与检测

2.2.8 Western blot

2.3 统计学方法

第3章 实验结果

3.1 一般情况观察及DAI评分

3.2 小鼠结肠长度变化

3.3 组织病理学评分

3.4 小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达

3.5 小鼠肝脏组织中Cyp4a14 mRNA及蛋白的表达

3.6 小鼠结肠组织中内质网应激蛋白mRNA检测结果

3.6.1 各组小鼠结肠IRE1α、XBP1u、XBP1s、IRE1βmRNA的表达

3.6.2 各组小鼠结肠PERK、ATF6、CHOP mRNA的表达

3.7 GRP78-ATF6-CHOP通路分子在野生型小鼠结肠的表达

3.7.1 野生型小鼠结肠GRP78、ATF6、CHOP mRNA的表达

3.7.2 野生型小鼠结肠GRP78、ATF6、CHOP 蛋白的表达

第4章 讨论

4.1 Cyp4a14基因敲除小鼠抵抗DSS诱导的肠炎

4.2 Cyp4a14对结肠炎小鼠内质网应激相关通路蛋白的影响

4.3 GRP78-ATF6-CHOP通路分子在野生型小鼠结肠炎中的表达

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读学位期间的研究成果