杨桃根提取物DMDD通过TLR4/TGFβ信号通路改善糖尿病肾病的机制研究

摘要

糖尿病肾病(Diabetic kidney disease，DKD)发病率高，危害性大，积极探索DKD的作用靶点及治疗药物意义重大。我们的前期研究发现，杨桃根提取物2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-环己二酮(DMDD)有改善糖尿病肾病的作用，但其作用机制不明。　　目的:　　本论文旨在研究DMDD对TLR4/TGFβ信号通路及相关蛋白表达的影响，探索DMDD防治DKD的作用机制。　　方法:　　1、体内实验:采用高糖高脂饲料联合低剂量链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)诱导的野生型小鼠及TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠为体内模型。野生型小鼠和TLR4-/-小鼠分别随机分为6组:空白对照组(NC)、模型组(DM)、阳性对照组(GQ)和DMDD高、中、低剂量组。空白对照组给予蒸馏水灌胃，其余各组均给予高糖高脂饲料。高糖高脂干预4周后，单次110mg/kg腹腔注射STZ复制2型糖尿病模型。造模成功后，阳性对照组在高糖高脂饲料基础上给予格列喹酮(10mg/kg·d-1)。DMDD高中低剂量组则在高糖高脂饲料基础上分别给予50、25和12.5mg/kg·d-1的DMDD。连续给药4周后，处死小鼠，测定一般指标及肾功能的变化。HE染色观察肾脏组织病理学改变，Masson染色观察纤维化情况的变化，透射电镜观察肾小管形态及纤维化情况的变化。免疫组化检测TLR4、BAMBI、TGFβ1、Smad2/3的表达水平，RT-PCR和Western-blot检测TLR4、BAMBI、TGFβ1、Smad2/3的mRNA和蛋白表达的变化。　　2、体外实验:以人肾小管上皮细胞（HK-2）为体外模型，采用高糖（60mmol/L葡萄糖）刺激HK-2细胞转分化。CCK8法确定DMDD的给药剂量，然后观察不同剂量DMDD对HK-2细胞转分化的影响。免疫荧光法、RT-PCR和Western-blot法检测TLR4和TGFβ/Smad信号通路的基因及蛋白表达的变化。进一步，通过慢病毒转染过表达及沉默BAMBI蛋白，RT-PCR和Western-blot检测TLR4和Smad2/3以及转分化相关指标E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达的变化。　　结果:　　1、体内实验　　(1)高糖高脂联合STZ刺激可导致小鼠糖尿病肾病的发生，DMDD可以降低糖尿病小鼠的血糖和血脂，同时也可以改善胰岛素抵抗以及糖耐量和胰岛素耐量情况。　　(2)胱抑素C(CysC)和微量尿蛋白水平可以作为肾功能损害的敏感标志物，DMDD干预后可明显改善DKD小鼠的CysC和微量尿蛋白水平。　　(3)HE染色结果显示，在野生型小鼠中，糖尿病模型小鼠肾小球明显增大，基底膜异常增厚，间质出现炎症浸润以及纤维化，DMDD干预后，肾小球体积缩小明显，基底膜亦变薄，浸润的炎症及纤维化现象亦逐步减少，且病理改善随DMDD的剂量呈正相关变化。在TLR4-/-小鼠中，糖尿病模型组的病理改变程度较野生型同组比明显减轻，DMDD干预后，病理改变亦呈好转趋势。　　Masson染色结果显示，糖尿病组小鼠肾脏组织胶原沉积明显增加，DMDD干预后肾脏纤维病理改变明显减轻，而阳性对照组未发现明显的改善。与野生型小鼠相比，TLR4-/-小鼠的纤维化程度明显减轻。　　透射电镜显示，模型组肾间质成分明显增多，出现了较多的胶原纤维。当给予DMDD干预后，高中低各组的肾间质成分均明显减少，胶原纤维亦出现下降。阳性对照药物格列喹酮则无此效果。在TLR4-/-模型小鼠中，没有出现明显的纤维化。　　(4)免疫组化的结果显示，在野生型小鼠中，高糖高脂饮食与STZ刺激可使TLR4的表达明显增加，而给予DMDD干预后，TLR4的表达呈下降的趋势，且有剂量依赖性。在TLR4-/-小鼠中，没有检测到TLR4的表达，高糖高脂及STZ刺激亦没有增加TLR4的表达。　　TGFβ1在野生模型组中的表达明显升高，当给予DMDD治疗后，TGFβ1表达呈进行性下降，且有剂量依赖性。当TLR4基因敲除后，模型组的TGFβ1蛋白表达量与野生型同组比明显减少。Smad2/3作为TGFβ1调控的下游蛋白，其免疫组化结果表现与TGFβ1保持相同的趋势。　　与TGFβ1和Smad2/3相比，BAMBI的免疫组化结果呈现相反的趋势。无论是在野生型或TLR4基因敲除型小鼠中，空白对照组均有BAMBI蛋白表达出现，当给予高糖高脂和STZ刺激后，模型组小鼠BAMBI蛋白表达量均明显降低。DMDD干预后，各组的BAMBI表达均呈上升趋势，且呈剂量依赖性。　　作为阳性对照药物，格列喹酮对于以上几个蛋白在肾组织中的表达的变化几无影响，提示格列喹酮对糖尿病肾病的纤维化没有保护作用。　　(5)RT-PCR和Western-blot结果显示，TLR4-/-小鼠没有出现TLR4mRNA及蛋白的表达。而野生型小鼠中，模型组的TLR4mRNA和蛋白表达均明显升高，当给予DMDD干预后，TLR4表达水平均下降，且呈剂量依赖性。　　BAMBI的mRNA和蛋白表达在TLR4-/-小鼠中各组之间无明显差异，而在野生型小鼠中，当给予高糖高脂联合STZ刺激后BAMBI的mRNA和蛋白表达水平均明显降低;再给予DMDD干预，各组的BAMBI又呈现不同程度的上升，中、高剂量组更明显。　　TGFβ1和Smad2/3的mRNA和蛋白表达表现出相似的趋势，在TLR4基因敲除型小鼠中，模型组的TGFβ1和Smad2/3的mRNA和蛋白均无明显改变，DMDD干预亦未见明显变化。在野生型小鼠中，模型组的TGFβ1、Smad2/3的mRNA和蛋白表达均明显升高，再予DMDD干预后，TGFβ1和Smad2/3的mRNA和蛋白均呈下降趋势，且呈剂量依赖性。　　阳性对照药格列喹酮对于上述相关蛋白的mRNA和蛋白的表达没有明显的影响，提示格列喹酮保护糖尿病肾病的作用机制与TLR4-TGFβ-Smad2/3信号通路无关。　　2、体外实验　　(1)CCK8确定DMDD对HK-2细胞的IC50值为80μmol/L，据此浓度进行实验，确定DMDD的高中低剂量浓度分别为:40、20和10μmol/L。　　(2)高糖刺激HK-2细胞后，其形态没有发生明显的变化。划痕实验显示上皮细胞运动迁徙能力增强，表现出纤维细胞的特性，提示高糖的存在使细胞发生了EMT。此外RT-PCR和Western-blot结果显示，在高糖刺激下EMT指标E-cadherin表达下降，而Vimentin表达升高，提示上皮细胞发生了转分化。当给予DMDD干预后，E-cadherin相对表达量明显升高，而Vimentin则明显降低。　　(3)免疫荧光结果显示，高糖刺激后HK-2细胞的TLR4和pSmad2/3表达明显升高，而BAMBI则表达降低。经DMDD的干预后，TLR4表达出现明显下调。　　(4)当加入TLR4阻断剂TAK-242抑制TLR4的功能后，RT-PCR和Western-blot结果显示，高糖诱导HK-2细胞中的E-cadherin表达增多，而Vimentin则呈下降趋势。　　(5)过表达BAMBI后，HK-2细胞EMT程度明显降低;沉默BAMBI后，EMT增强。沉默后再用高糖刺激以及DMDD干预，EMT无明显变化。　　(6)作为BAMBI的下游调控蛋白，Smad2/3的表达水平与BAMBI呈负相关。过表达BAMBI，Smad2/3的表达下调;当BAMBI沉默后，Smad2/3的mRNA及蛋白表达相应上调，此时继续使用高糖刺激以及DMDD干预，Smad2/3表达无明显变化。　　结论:　　(1)DMDD具有改善糖尿病肾病小鼠肾功能的作用。　　(2)DMDD可明显减少糖尿病肾病小鼠TLR4及TGFβ-Smad2/3的蛋白表达。　　(3)TLR4与TGFβ-Smad2/3信号通路之间通过BAMBI存在信号交叉。　　(4)DMDD通过调控TLR4-TGFβ/Smad2/3信号通路来减缓EMT的发生从而改善糖尿病肾病。

目录

声明

个人简历

中英文缩略词表

摘要

前言

第一章DMDD对高糖高脂饮食联合STZ诱导的DKD小鼠的影响

1实验材料

1．1实验动物与饲料

1．2主要药品及试剂

1．3 主要仪器和设备

2实验方法

2．1药物和试剂配制

2．2动物分组及建模

2．3给药干预

2．4一般指标测定

2．5葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验

2．6样品的采集和处理

2．7生物化学检测

2．8 Elisa测定相关指标

2．9石蜡切片

2．11 Masson染色

2．12肾组织的透射电镜观察

2．13免疫组织化学法测定肾组织中相关蛋白表达

2．14 RT-PCR法检测mRNA表达

2．15 Western-blot检测肾组织相关蛋白表达

2．16统计学分析

3结果

3．1小鼠一般情况

3．2 DMDD对小鼠体重和肾重的影响

3．3 DMDD对小鼠血脂的影响

3．4 DMDD对小鼠血糖的影响

3．5 DMDD对葡萄糖耐量及胰岛素耐量的影响

3．6 DMDD对血清胰岛素的影响

3．7 DMDD对小鼠肾功能的影响

3．8 DMDD对糖尿病小鼠肾脏组织病理学的影响

3．9肾组织相关蛋白的免疫组化结果

3．10RT-PCR结果

3．11 Western-blot结果

4讨论

5小结

第二章DMDD对高糖诱导的HK-2细胞转分化的保护作用

1实验材料

1．1细胞

1．2药物

1．3主要试剂

1．4主要仪器和设备

2实验方法

2．1药物和试剂配制

2．2细胞培养操作

2．3慢病毒转染

2．5划痕实验观察HK-2细胞迁徙情况

2．6 CCK-8法确定DMDD剂量

2．7 ELISA法测定相关因子

2．8 HK-2细胞凋亡检测

2．9免疫荧光

2．10 RT-PCR法检测mRNA表达水平

2．11 Western-blot检测细胞相关蛋白表达

2．12统计学分析

3研究结果

3．2高糖对HK-2细胞形态的影响

3．4高糖对HK-2细胞TLR4、BAMBI和p-Smad2／3的表达的影响

3．5高糖刺激HK-2细胞EMT

3．6 DMDD抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT

3．7 DMDD通过下调TLR4抑制TGF-β／Smad信号减少EMT

3．8 DMDD通过TLR4-BAMBI-TGFβ／Smad信号通路介导HK-2细胞发生EMT

3．9 DMDD对炎症因子的影响

3．10 DMDD对HK-2细胞凋亡的影响

4讨论

5小结

全文总结

综述 糖尿病肾病发病机制的研究进展

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文