抗肿瘤天然产物CC-1065和YM-216391生物合成相关基因功能研究

摘要

CC-1065是1978年由美国Upjohn公司发现的，它是由链霉菌Streptomyces ZelensvsNRRL11183发酵培养基中分离出的一类具有抗真菌和高抗肿瘤活性的的微生物次级代谢产物。它与已发现的Yatakemycin，DuocarmycinA，DuocarmycinSA等属于同一家族，这类家族的骨架部分是由吲哚与两个吡咯吲哚环通过两个酰胺键连接组成。CC-1065分子中药效基团---环丙烷苯并二吡咯亚基对细胞的有丝分裂期G2期和M期起作用，其作用机制是直接与DNA共价结合，形成更加稳定的结构，这样稳定的DNA结构很难被解旋，从而难以复制DNA，起到强大的抑制肿瘤细胞繁殖的能力。
　　 虽然CC-1065有较强的抗肿瘤活性，但是其水溶性较差，对肝肾也有比较大的毒性，在临床应用受到了限制，所以我们希望了解其生物合成机制来进行结构改造，从而研制出毒性较小，药性更强的新型化合物。
　　 在本课题组蹇晓红博士克隆得到的完整的CC-1065基因簇的基础上，对基因簇进行详细的序列分析，整个基因簇共包含38.626kb，29个ORF。另外我们推测每个基因最有可能的功能及其在CC-1065生物合成中所起的作用，进而对CC-1065的生物合成机制提出合理假设。
　　 本工作主要研究重点是CC-1065基因簇中的10个基因的功能分析。通过基因敲除，我们发现其中c10V，c10K,c10E,c10S,c100这5基因突变株发酵产物HPLC检测显示中断了CC-1065的产生，c10W，c10D,c10R6这3个基因突变株的发酵结果显示未中断CC-1065的产生。还有在抗性基因c10R5的敲除和回补实验中，我们发现缺失突变株ΔR5较野生型减少了17％，回补突变株ΔR5-回补较野生型增加了5％，我们推测这与抗性基因自我保护机制有关。另外在c10A敲除实验中，发现有一个m/z=432(M+NH4)新化合物的积累，这个新化合物的分离鉴定将有可能揭示CC-1065部分生物合成机制。这些基因功能的初步研究为下一步揭示CC-1065的生物合成途径打下了基础。同时为以后的相关酶催化研究创造了有力的开局。
　　 我们课题组另外对具有代表性的环肽YM-216391进行了初步研究。环肽YM-216391是含多恶唑-噻唑环的大环天然产物，具有良好的抗肿瘤活性。此前实验室已经克隆得到其生物合成基因簇，为了探讨环肽YM-216391的异源合成，本研究将包含YM-216391合成整个基因簇的粘粒导入不同的链霉菌中，结果显示，YM-216391在几个不同的链霉菌宿主中都实现了异源表达，其中在S.albus中产量最高，在此基础上，经过培养基配方改进，YM-216391产量可达到5.664±1.176mg/L，为通过组合生物合成产生新化合物等后续研究提供了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 抗肿瘤天然产物的研究现状

1．2 抗肿瘤天然产物CC-1065研究现状及前期的研究基础

1．3 CC-1065主要研究策略和目标

1．4 抗肿瘤抗生素CC-1065研究意义

1．5 抗肿瘤新型环肽YM-216391研究现状及意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 质料

2．1．3 仪器

2．1．4 试剂

2．1．5 培养基

2．1．6 裂解和缓冲溶液

2．2 实验方法

2．2．1 钙法感受态细胞的制备

2．2．2 感受态细胞的转化

2．2．3 PCR的处理和PCR产物的克隆

2．2．4 DNA连接与酶切

2．2．4 Streptomyces NRRL 11183孢子的制备

2．2．5 Streptomyces NRRL 11183和E.coilS17-1属间接合转移

2．2．6 接合子筛选与双交换突变株的验证

2．2．7 Streptomyces NRRL 11183突变株发酵产物的提取和HPLC检测

第三章 抗肿瘤天然产物CC-1065生物合成机制研究

3．1 抗肿瘤天然产物CC-1065生物合成基因簇的功能分析

3．2 CC-1065可能的生物合成途径

3．3 基因功能研究

3．3．1 c10V基因功能研究

3．3．2 c10K基因功能研究

3．3．3 c10S基因功能研究

3．3．4 c10E基因功能研究

3．3．5 c10O基因功能研究

3．3．6 c10W基因功能研究

3．3．7 c10D基因功能研究

3．3．8 c10R6基因功能研究

3．3．9 c10R5基因功能研究

3．3．10 c10A基因功能研究

3．4 本章总结

第四章 抗肿瘤环肽YM-216391在异源宿主中的生物合成

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株及质粒

4．1．2 培养基、材料

4．1．3 属间接合转移

4．1．4 发酵及产物分离

4．1．5 HPLC及质谱检测

4．2 结果

4．2．1 基因工程菌株构建及鉴定

4．2．2 基因工程菌株产生YM-2163HPLC定性分析

4．2．3 基因工程菌株合成YM-216391的质谱鉴定

4．2．4 不同宿主菌对合成YM-216391产量影响

4．2．5 S.albus合成YM-216391发酵培养基改进

4．3 讨论

参考文献

附录1：本工作中构建的质粒及测序引物

附表1．1 构建的重组质粒

附表1．2 用于PCR引物

致谢

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