5’--核苷酸酶YB92的结构与功能的研究

摘要

5'-核糖核苷酸水解酶简称5'-核苷酸酶(5'-NT)，5'-NT能够水解多种核糖核苷-5'-磷酸和脱氧核糖核苷-5'-磷酸，最终生成相应的核苷和无机磷酸。在生物细胞中有多种酶参与核苷酸的生物合成和代谢分解，以保证核苷酸和核苷的量处于适当水平。核苷酸和核苷的库存量保持动态平衡，这有利于实现DNA和RNA的有效合成。由于5'-NT能够催化5'-核苷酸产生相应的核苷和磷酸从而能够调节体内核苷酸和核苷水平，这一机制在体内发挥着重要作用。与核苷酸酶作用相反的是核苷酸激酶，核苷酸激酶能够催化核苷与无机磷酸生成相应的核苷酸。 5'-核苷酸酶的分布较为广泛，例如细菌、植物细胞和脊椎动物组织等都含有5'-核苷酸酶。根据5'-核苷酸酶含有的保守结构域分类，主要分为HAD家族和HD家族，HAD家族的5'-核苷酸酶目前研究较多，HD家族的5'-核苷酸酶在真核生物中尚未有研究。YB92是一种重要的5'-核苷酸酶，它能够将5'-核苷单磷酸水解为相应核苷和磷酸。YB92结构上含有HD结构，具有HD结构域的蛋白可具有核苷酸酶和磷酸二酯酶活性，并且它们在信号传导和核苷酸代谢中起重要作用。 利用生物化学方法和结构生物学方法对酿酒酵母的HD结构域蛋白YB92(YBR242W)的结构和功能进行研究。通过核苷单磷酸与YB92反应实验，表明了YB92(YBR242W)是核苷5'-单磷酸水解酶，YB92蛋白的脱氧核糖核苷5'-单磷酸酶的活性超过核糖核苷5'-单磷酸酶的活性;核苷三磷酸抑制试验表明，核苷三磷酸抑制YB92(YBR242W)水解核苷单磷酸。通过对YB92蛋白进行大规模的纯化表达，将蛋白进行蛋白质晶体生长条件筛选和优化，得到了质量较高的晶体，用X射线对晶体进行衍射，解析了YB92-ATP复合物的晶体结构。从结构上看，YB92是由8个a螺旋和4个反向平行的β折叠组成。通过比对发现YB92的结构类似于来自大肠杆菌的HD家族的YfbR晶体结构，将两个结构叠加后，推断YB92可能和YfbR具有相同的催化底物结合位点。分子筛柱层析色谱和交联实验研究表明，溶液中的YB92蛋白以二聚体形式存在，这与YB92结构的观察的结果和分析结果一致。将HD结构域活性中心附近的一些保守氨基酸进行定点突变，发现与二价金属配位氨基酸残基以及活性位点附近保守残基对YB92活性至关重要。与金属离子配位Asp79、His80、His108和Asp109残基，活性位点附近的保守E112和E133点对催化活性是至关重要的。此外，从结构上看，YB92的K59穿过界面进入到另一单体靠近活性中心位置，推测K59与相邻分子中的活性中心部分氨基酸残基(E75/E181/Q185)有氢键相互作用，用生化实验进一步验证了K59影响整个YB92的催化活性。总之，结构比对和突变研究结果表明YB92在酿酒酵母中起5'-核苷酸酶的作用。