创伤弧菌溶细胞素抗原表位预测、鉴定及免疫机制的探索

摘要

目的： 用生物信息软件预测出创伤弧菌溶细胞素(vibriovulnificuscytolysin)的抗原表位，利用噬菌体展示技术构建噬菌体表位肽，筛选出有效抗原表位；并对创伤弧菌溶细胞素表位肽的免疫应答机制进行探索，为下一步研制创伤弧菌多抗原肽疫苗(MAP)奠定基础。 方法： 1、溶细胞素T细胞和B细胞表位的预测采用PropredHLA-DRbindingpeptideprediction-ProPred的预测服务器(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)以及EMBOSS软件包中ANTIGENIC程序(http://bioinfo.hku.hk/EMBOSS/)、结合创伤弧菌溶细胞素(Vvha)的二级结构预测Vvha的T和B细胞表位，并根据Swiss-model提供的信息分析Vvha的B细胞表位的空间结构从而选取联合的T，B细胞表位进行研究。 2、重组噬菌体展示肽系统的构建及鉴定PCR扩增法获取表位基因片段，分别用Acc65I，EagI酶酶切质粒M13KE和表位基因片段，然后分别切胶回收酶切的目的片段，加入合适的T4连接酶，16℃连接过夜，转化感受态细胞E.coli2738中。将被转化E.coli.ER2738、IPTG/X-gal、溶化后冷却至47℃左右顶层琼脂混匀，倾注于含四环素(10mg/ml)的LB平板上，37℃培养6h后观察结果。将噬菌斑小量培养后为模板，采用检测引物(表1)进行PCR初步鉴定后测序。 3、表位的初步筛选及鉴定采用10％分离胶的SDS-PAGE，含不同重组PⅢ蛋白(rPⅢ)噬菌体的上样量均为1×1012，考马斯亮蓝染色后观察各rPⅢ表达情况。重组蛋白rVvc兔抗血清为一抗，采用Westernblot对上述表位肽进行初步鉴定。实验中以无任何插入片段的等量野生型噬菌体作为对照。 4、创伤弧菌溶细胞素表位肽免疫应答机制的探索小鼠腹腔免疫法测定各重组噬菌体的抗体效价；采用CCK-8试剂盒确定重组噬菌体的最佳刺激浓度后，采用流式细胞术检测各重组噬菌体免疫后的小鼠CD4+/CD8+T淋巴细胞比值、ELISA细胞因子检测试剂盒检测各重组噬菌体免疫后的小鼠IFN-r、IL-2、IL-4、IL-6细胞因予浓度。 结果： 1、Vvha表位预测结果及其选择根据评分分数及T细胞和B细胞表位重叠情况，选择Vvha1(194-217)、Vvha2(332-352)、Vvha3(295-314)、Vvha4(62-80)四个表位，Swiss-model显示这四个表位均位于Vvha分子表面。 2、噬菌体展示肽系统的构建参照噬菌体展示系统试剂盒说明书和分子克隆书，用含四环素LB液体培养基小量培养有正确插入序列的目的重组噬菌体，PCR反应、SDS-page电泳结果显示重组的噬菌体中确实插入了目的表位片段。 3、表位的初步筛选与鉴定SDS-page电泳及Westernblot结果显示与野生型M13KE相比，重组的噬菌体中确实插入了目的表位片段，且M13KE-Vvha2、M13KE-Vvha3、M13KE-Vvha4反应强度高于M13KE-Vvha1。 4、表位肽免疫应答机制的探索抗体效价结果显示四个重组噬菌体表位肽的免疫原性均较高。流式细胞术及细胞因子测定表示重组噬菌体免疫后诱导机体T淋巴细胞向Th1、Th2型转化，尤以Th1型转化明显，统计学分析，M13KE-Vvha2、M13KE-Vvha4免疫后机体在这两项检测中变化相对高。 结论： 本实验成功预测创伤弧菌溶细胞素(vibriovulnificuscytolysin)的抗原表位，并对创伤弧菌溶细胞素表位肽的免疫机制进行探索，筛选出有效抗原表位肽M13KE-Vvha2、M13KE-Vvha4；为下一步研制多抗原肽疫苗(MAP)奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分创伤弧菌溶细胞素抗原表位的预测及鉴定

材料与方法

结果

分析与讨论

第二部分创伤弧菌溶细胞素表位肽免疫应答机制的探索

材料与方法

结果

分析与讨论

全文小结

参考文献

附录

致谢

综述生物信息学方法在抗原表位预测中的应用