生物絮团对罗氏沼虾幼体养殖水体的改良作用及罗氏沼虾双顺反子病毒ELISA检测

摘要

目的：
　　 通过研究应用生物絮团技术的罗氏沼虾育苗水体各项指标:氨氮、亚硝酸盐、溶解氧、葡萄糖残留、生化需氧量和生物絮团含量的变化及水体中的微生物多样性的变化，阐明不同的葡萄糖添加浓度时生物絮团对罗氏沼虾育苗水质的影响，初步确定较好的葡萄糖使用浓度，为发展更经济环保的育苗方法提供基础资料和科学依据。同时，利用罗氏沼虾双顺反子病毒外膜蛋白编码基因VP3，进行原核表达和动物免疫，获得多克隆抗体，初步建立ELISA检测方法，为建立该病毒的快速简便检测方法及双顺反子病毒的深入研究奠定基础。
　　 方法：
　　 1.在浙江南太湖淡水水产种业有限公司进行为期27天的育苗实验，期间对水体的各项指标进行不间断检测，及时保存后续实验所需的生物絮团及虾苗样品。
　　 2.根据实验室自行设计的引物对保存的幼体进行罗氏沼虾双顺反子病毒PCR检测。利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析微生物多样性变化，确定生物絮团技术对水体中微生物多样性的影响。
　　 3.根据罗氏沼虾双顺反子病毒的全基因序列，选取病毒外膜蛋白VP3的编码基因，设计引物，序列如下:上游F:CGGAATTCATGXAGAGCAATATGCTTCTCTT，下游R: ACGCGTCGACTTACCTGGATGGCCCATAAGT。构建克隆载体及表达载体，获得可稳定表达蛋白的重组细菌，获得表达蛋白，进行动物免疫获得高效价多克隆抗体血清。
　　 4.通过不同组ELISA实验摸索并确定最适抗原包被浓度、包被条件、封闭时间、孵育时间、酶标二抗作用时间、显色时间和灵敏度等，初步建立罗氏沼虾双顺反子病毒的ELISA快速检测方法。
　　 结果：
　　 1.各组生物絮团含量无显著差异。葡萄糖终浓度为20 mg/L组的氨态氮和亚硝酸氮显著低于对照组(T-test，P＜0.05)，溶解氧和化学需氧量(COD)在试验组与对照组之间不存在显著差异。生物絮团技术应用于罗氏沼虾育苗中，对水体中溶氧含量无明显影响，但对氨氮盐和亚硝酸氮盐含量有较高的去除能力。出苗率及生长测定表明，对照组出苗率为32.60％，20 mg/L试验组为60.60％，比对照组高了85.90％。对照组仔虾体长平均值为8.193 mm，20 mg/L试验组体长平均值为10.488 mm，比对照组高了28.00％。
　　 2.2.DGGE结果显示，所有组中均检测出盐螺旋藻属细菌。除此之外，相较于对照组，试验组中检测出芽孢杆菌属细菌，该属细菌大部分在水产上隶属于有益菌。相反对照组检测出气单胞菌属细菌和假单胞菌属细菌，且气单胞菌属细菌为优势菌群之一。试验组中检测出气单胞菌属细菌，但并不是优势菌群。
　　 3.通过PCR扩增，蛋白重组表达，抗体制备获得罗氏沼虾双顺反子病毒外膜蛋白VP3多克隆抗血清，间接ELISA和Westen-blotting实验结果显示获得的多克隆抗血清可特异性与重组表达蛋白及提纯病毒间发生反应，且特异性较高。
　　 4.ELISA实验结果显示，最适抗原包被浓度为1∶100;最适血清使用浓度为1∶8000;最佳包被条件为37℃2h后4℃过夜;最佳封闭条件为37℃1 h;最佳血清孵育时间为37℃1 h;最佳酶标二抗作用时间45 min;最佳显色时间15 min。应用该方法，可以检出实验室自备的阳性病毒样品，灵敏度为1∶103。
　　 结论：
　　 1.生物絮团技术的应用可以较好的控制水体中亚硝酸盐和氨氮的含量，但对溶解氧及COD的影响不大。生物絮团技术也可以促进幼体生长和提高幼体成活率。
　　 2.生物絮团技术可以改变水体中微生物的多样性，抑制各类致病菌和条件致病菌的生长，改善养殖环境。
　　 3.初步确定应用生物絮团技术时，最适葡萄糖添加浓度为20 mg/L。
　　 4.罗氏沼虾双顺反子病毒ELISA方法的建立，可以初步应用于相关病样的检测。

目录

缩略词表

摘要

引言

本研究的目的和意义

第一章 生物絮团技术在罗氏沼虾育苗中的应用

1 材料与方法

1．1 试验材料与设备

1．2 主要试剂

1．3 试验设置

1．4 水质检测

1．5 生物絮团含量检测

1．6 生物絮团的分子检测

1．7 仔虾生长测定

1．8 幼体病毒检测

2 结果

2．1 亚硝酸氮、氨氮浓度变化

2．2 溶解氧和COD浓度变化

2．3 葡萄糖浓度变化

2．4 生物絮团含量

2．5 DGGE图谱和生物絮团微生物多样性分析

2．6 仔虾病毒检测及生长状况的比较

3 讨论

第二章 罗氏沼虾双顺反子病毒ELISA检测方法建立

1 材料与方法

1．1 设备

1．2 主要试剂

1．3 引物设计

1．4 重组表达质粒的构建

1．5 重组蛋白的诱导表达、鉴定及最佳诱导时间的确定

1．6 新西兰大白兔抗血清的制备及效价测定

1．7 Western blot检测

1．8 确定抗原最适包被浓度

1．9 确定血清最低工作浓度

1．10 确定最佳包被条件

1．11 确定最佳封闭条件

1．12 确定最佳血清孵育时间

1．13 确定酶标二抗最佳作用时间

1．14 确定最佳显色时间

1．15 样品检测

1．16 灵敏度检测

2 结果

2．1 目的基因的扩增及重组表达载体的构建

2．2 重组蛋白的诱导表达、鉴定及最佳诱导时间的确定

2．3 抗体血清效价测定

2．4 Western blot检测

2．5 最适抗原包被浓度的确定

2．6 最低血清工作浓度的确定

2．7 确定最佳包被条件

2．8 确定最佳封闭时间

2．9 确定最佳血清孵育时间

2．10 确定酶标二抗最佳作用时间

2．11 确定最佳显色时间

2．12 样品检测

2．13 灵敏度检测

3 讨论

第三章 结论与展望

1 主要研究结论

2 研究展望

参考文献

致谢

文献综述

附录 在校期间发表论文

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