应用半理性设计策略提高卤醇脱卤酶HheC的活性和立体选择性

摘要

卤醇脱卤酶可以催化环境污染物中邻卤醇的碳-卤键断裂生成光学纯的环氧化物,并且卤醇脱卤酶HheC对芳香族邻卤醇具有较高的对映体选择性,也能接受不同的亲核试剂进行环氧化物开环反应形成高价值光学纯的β-取代醇。因此,卤醇脱卤酶既可以降解环境的含卤污染物,也可以生产高价值的手性药物中间体,所以受到工业生产的重视。
　　最近的研究显示,底物结合口袋内部的氨基酸对酶的立体选择性和活性有重要的影响。为了获得影响卤醇脱卤酶HheC在脱卤反应中催化性质的规律性信息,本文利用HheC已知的三级结构信息,将活性口袋范围内的氨基酸分成了5组,构建了5个CASTing文库。在完成了对CASTing文库的活性和立体选择性的筛选之后,发现每个文库对改变活性或者立体选择性都有着不同的趋势。并且经过对每个文库中良性突变体序列的分析,获得了这些良性突变体突变位点突变后的规律性信息。之后,将对立体选择性改变的文库组合构建了2个ISM文库,并筛选了800个突变体之后,最终获得了针对(R)-2-CPE,对映体选择性得到提高的HheC突变体L142F/N176H(由ER=65提高到ER=132),以及对映体选择性得到逆转的突变体P84V/F86P/T134A/N176A(由ER=65逆转到ES=101)。同时,将对活性提高有帮助的两个文库组合成第三个 ISM文库,获得了针对1,3-DCP,大量催化活性得到提高的突变体。并且本文中所获得的良性突变体,可以不同的将前手性1,3-DCP转化为表氯醇,其中突变体P84A/F86P/T134A对映体过量e.e.p提高了38倍的可以生产出(S)-表氯醇。同时,在对卤醇脱卤酶HheC的开环反应初探中,也得到了针对不同底物,立体选择性逆转和提高的突变体。
　　最后,通过CASTing文库中所得到得规律性信息,以及分子模拟对接实验和稳态动力学参数,确定了影响卤醇脱卤酶HheC立体选择性得关键位点为P84,F86, T134,L142和N176位。他们之间有着极其复杂的协调机制来控制HheC的立体选择性。当P84,F86,T134和N176突变成小侧链氨基酸时,卤醇脱卤酶HheC对(S)-2-CPE有很强的偏好性,而当T134,L142和N176突变成较大侧链的氨基酸时,HheC对(R)-2-CPE有极强的偏好性。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

20种常见氨基酸的中英文对照及缩写

文中涉及的化合物的中英文名称对照及缩写

目录

第一章 绪论

1.1卤醇脱卤酶HheC的研究现状和应用

1.2酶的改造

1.3本论文研究的内容

第二章 CASTing 文库的构建，筛选及结果分析

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.4本章总结

第三章 ISM 文库的构建，筛选和突变体的分析

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与讨论

3.4本章总结

第四章 总结及展望

4.1总结

4.2展望

致谢

参考文献

附录

攻硕期间的研究成果