弓形虫感染宿主细胞磷酸化蛋白质组学分析及宿主细胞蛋白vimentin在弓形虫感染过程中的作用机制研究

摘要

背景与目的：磷酸化作为一种重要的转录后调控方式，其在蛋白功能调节、细胞信号转导等方面起着至关重要的作用。研究显示蛋白磷酸化在弓形虫感染宿主细胞过程中广泛存在，并发挥着重要的调节作用。而弓形虫作为一种专性细胞内寄生虫，其感染宿主细胞是一个复杂的、渐进的过程，但目前关于弓形虫感染不同时期的宿主细胞的磷酸化蛋白质组学分析却非常有限。
　　宿主细胞蛋白vimentin是一种Ⅲ型中间丝骨架蛋白，其在细菌、病毒等病原体的入侵、增殖方面起着重要作用，但其在弓形虫感染宿主细胞过程中的作用目前仍未见报道。本研究进行了弓形虫感染不同时期宿主细胞磷酸化蛋白质组学分析，并探讨了宿主细胞蛋白vimentin在弓形虫感染宿主细胞过程中盼作用。
　　方法：体外收集细胞培养RH株弓形虫速殖子，并感染HFF细胞(MOI=3)。收集未感染组(UI)、感染弓形虫30min组(EI)以及28h组(LI)细胞，并提取总蛋白，进而采用iTRAQ的方法对不同处理组进行磷酸化蛋白质组学分析，并对采用western blot(WB)方法对定量结果进行验证。
　　弓形虫感染宿主细胞不同时间后，分别采用免疫荧光以及WB的方法对宿主细胞蛋白vimentin的分布、可溶性、磷酸化以及表达水平进行分析。进而用RH-GFP株弓形虫分别感染HBMEC和HBMECΔVim细胞，并统计分析不同感染组弓形虫入侵、增殖以及释放效率。采用FRET和Co-IP的方法验证vimentin与TgROP18的相互作用。进而采用CRISPR-Cas9的方法构建rop18缺陷虫株，并用其感染宿主细胞，应用同样的方法分析感染后细胞vimentin的可溶性、磷酸化以及表达水平的变化。同时，采用过表达以及体外磷酸化的方法评价TgROP18对vimentin可溶性、表达水平以及磷酸化的影响。
　　结果：本次实验共鉴定出3962条肽段(1541个蛋白)，1207条磷酸化肽段(665个磷酸化蛋白)，1031个磷酸化位点（丝氨酸磷酸化位点880个，苏氨酸磷酸化位点138个，酪氨酸磷酸化位点13个）。将不同比较组磷酸化水平差异倍数大于或等于1.5倍且p value值小于0.05的磷酸化蛋白定义为显著差异蛋白。本次实验共鉴定出105个显著差异蛋白，其中EI/UI组有47个显著差异蛋白，U/UI组有67个显著差异蛋白，LI/EI组有40个显著差异蛋白。不同比较组显著变化磷酸化蛋白功能分析结果显示：在弓形虫感染宿主细胞早期可能通过磷酸化调节宿主细胞周期、凋亡、免疫、代谢从而促进其在宿主细胞内增殖，而在弓形虫感染宿主细胞早期，弓形虫可能利用宿主细胞内能量，细胞膜组分以及调节宿主细胞骨架，从而利于弓形虫入侵宿主细胞及其在宿主细胞内纳虫泡的形成。
　　弓形虫感染宿主细胞会引起宿主细胞蛋白vimentin的重排及其可溶性、磷酸化、表达水平的改变。与正常组比较，Vimentin敲除以后，弓形虫的入侵宿主细胞效率显著提高(p＜0.05），而弓形虫在宿主细胞内的增殖及释放效率没有显著变化(p＞0.05）。宿主细胞蛋白vimentin与TgROP18存在相互作用，且其可溶性及磷酸化水平受TgROP18调节。
　　结论：弓形虫感染的不同时期，磷酸化蛋白参与调节的宿主细胞进程呈现显著差异。弓形虫感染宿主细胞引起vimentin重排，及其可溶性、磷酸化、表达水平的变化，且其可溶性及磷酸化的变化受TgROP18调节。宿主细胞蛋白vimentin抑制弓形虫入侵宿主细胞，但对弓形虫的增殖和释放无显著影响。宿主细胞蛋白vimentin在小鼠脑组织中的表达水平相对较低。

目录

摘要

前言

第一章 弓形虫感染宿主细胞磷酸化蛋白质组学分析

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二章 宿主细胞蛋白vimentin在弓形虫感染宿主细胞过程中的作用机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

本论文的成果和创新性

参考文献

附录

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