昭通天麻DNA条形码研究及药用成分分析

摘要

天麻（Gastrodia elata Bl.）隶属于兰科(Orchidaceae)、兰亚科(Subfam.Orchidoideae)、树兰族(Trib.Epidendreae)、天麻亚族（Subtrib.Gastrodiinae）天麻属(Gastrodia R.Br.)腐生草本植物，无根无绿叶，与蜜环菌(Armillaria mellea(Vahl ex Fr.) Karst.)共生。天麻以块茎入药，是主产于我国的名贵中药，在我国已有两千余年的用药历史。《中国植物志》记载天麻属在我国分布有13种，昭通地区所分布的主要为天麻（G.elataBl.）的4个变型，即红天麻（G.elataBl.f.elata）、绿天麻(G.elata Bl.f.viridis Makino)、乌天麻(G.elata BI.f glaucaS.Chow)、黄天麻(G.elata Bl.fflavidaS.Chow)。本文综合应用了形态学、DNA条形码技术和化学成分分析等手段和方法对昭通天麻黄、绿、乌3个变型的分类进行了研究。主要研究结果如下：
　　 ⑴天麻的形态分类研究。昭通天麻植物形态特征差异明显，从株高、花色、茎秆颜色以及块茎表型性状可直观对天麻3个变型——乌天麻、黄天麻、绿天麻进行形态分类。3个变型天麻块茎表型性状具有一定程度的多样性。乌天麻个体较大，与黄天麻和绿天麻差异明显，且乌天麻遗传变异稳定，可作为栽培天麻的优质种源。天麻块茎各表型性状变型间变异大于变型内变异，从这个意义上来说，变型间变异是天麻的主要变异来源;天麻药材由于经过加工炮制，3个变型之间的药材形态特征已经很接近，形态鉴别困难。
　　 ⑵昭通天麻的DNA条形码研究。分析比较了ITS、matK、rbcL、trnH-psbA、trnL-F五个DNA条形码候选序列在天麻不同变型内和变型间的鉴别效果，并对组合片段ITS+rbcL的鉴定效果进行了评估。在天麻ITS、rbcL、matK和trnH-psbA基因中，仅ITS和rbcL得到扩增，但变型内变型间没有明显的barcoding gap，上述通用条码不适合作为昭通天麻种下变型DNA条形码的研究，但是ITS序列可作为不同居群天麻的分子鉴别研究;叶绿体基因片段rbcL和trnH-psbA的成功扩增，推测天麻叶绿体仍未退化完全。从ITS序列分析得出，黄天麻与乌天麻亲缘关系最近，其次是绿天麻与黄天麻，乌天麻与绿天麻亲缘关系最远;天麻ITS序列在变型内和变型间大部分个体变异较小，仅有少部分个体变异较大，变异主要发生在ITS1区;就变型内来说，绿天麻的遗传变异最大，乌天麻和黄天麻遗传变异较小，乌天麻和黄天麻遗传稳定，有利于天麻的遗传育种。昭通天麻与贵州大方天麻的亲缘关系较近，而与陕西汉中天麻的亲缘关系却相对较远，不同来源相同变型天麻的ITS序列差异明显，而相同来源不同变型间的ITS序列同源性较高。天麻共生菌不是单一的蜜环菌(Armillaria mellea(Vahl ex Fr.) Karst.），大部分是蜜环菌属(Armillaria spp.)的其他种，各蜜环菌种与各变型天麻的共生并非一一对应关系。天麻共生菌可能还含有小菇属（Mycena）真菌，但是未发现有小菇属真菌紫萁小菇（Myeena osmundieola Lange）存在。
　　 ⑶昭通天麻药用成分研究。经HPLC检测，各变型天麻天麻素含量:干品乌天麻＞鲜品红天麻＞鲜品黄天麻＞鲜品绿天麻＞鲜品乌天麻;对羟基苯甲醇含量:鲜品绿天麻＞鲜品红天麻＞鲜品黄天麻＞鲜品乌天麻＞干品乌天麻;腺苷含量:鲜品红天麻＞干品乌天麻＞鲜品黄天麻＞鲜品乌天麻＞鲜品绿天麻;对羟基苯甲醛含量:干品乌天麻＞鲜品乌天麻＞鲜品绿天麻＞鲜品黄天麻＞鲜品红天麻。鲜品天麻的天麻素含量均低于干品天麻，药用天麻以炮制加工后的成品麻为佳。不同变型天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、腺苷和对羟基苯甲醛含量均有一定差异，但暂未发现其变化的规律性。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

第一章 天麻的分类研究

1．天麻植物的分类学简史

1．1 天麻的本草考证

1．2 天麻属植物的分类学研究

1．3 天麻属植物形态特征

1．4 天麻及其种下变型的分类概述

2．昭通天麻的来源组成及特征

3．昭通天麻3个变型块茎的表型性状分析

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 统计结果与分析

4．小结与讨论

第二章 昭通天麻DNA条形码研究

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液配制

1．5 实验方法

1．6 数据处理

2．结果与分析

2．1 改良CTAB法提取天麻不同部位DNA

2．2 天麻药材总DNA提取

2．3 PCR扩增效率及测序成功率

2．4 数据分析

3．小结与讨论

第三章 昭通天麻药用成分分析

1．仪器与试药

1．1 仪器

1．2 试药

2．方法与结果

2．1 天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定

2．2 腺苷和对羟基苯甲醛的含量测定

3．小结与讨论

第四章 结论

第五章 文献综述

1．植物DNA条形码的研究概况

1．1 DNA条形码技术的概念

1．2 植物DNA条形码候补片段的研究

1．3 DNA条形码技术鉴定流程

2．兰科植物DNA条形码的研究

3．天麻属的研究背景

3．1 天麻的本草考证

3．2 天麻种质资源研究

3．3 天麻不同变型的分类鉴定及亲缘关系研究

3．4 天麻共生菌研究

3．5 天麻的化学成分研究

参考文献

附录

致谢