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耐辐射球菌中priA类似基因(dr2606)功能的研究

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1.文献综述

1.1 PriA在复制又重启动中的研究进展

1.1.1 复制又重启动过程的重要性

1.1.2 PriA在ΦX174噬菌体复制中的作用

1.1.3 一些菌种中的PriA蛋白活性

1.1.4 大肠杆菌中的PriA蛋白活性

1.2 耐辐射球菌的研究进展

1.2.1 耐辐射球菌概况

1.2.2 耐辐射球菌极端抗性的研究

1.3 本研究的目的,意义

2.研究方法

2.1 实验材料

2.1.1 数据库

2.1.2 菌株和试剂

2.1.3 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 时辐射球菌中dr2606的生物信息学分析

2.2.2 突变株的构建

2.2.3 补偿质粒及菌株构建

2.2.4 生长曲线测定

2.2.5 生存率测定

2.2.6 Dr2606突变株对各种逆境的生存率曲线分析

2.2.7 Dr2606突变株的利福平抗性片段转化效率分析

2.2.8 耐辐射球菌Dr2606突变株转录谱分析

2.2.9 Dr2606蛋白表达质粒的构建及蛋白纯化

3.结果与讨论

3.1 实验结果

3.1.1 耐辐射球菌中dr2606的生物信息学分析

3.1.2 突变株的鉴定及突变株对各种逆境的生存率曲线

3.1.3 野生株、突变株、补偿株生长曲线及生存率的比较

3.1.4 利福平抗性片段转化率分析

3.1.5 突变株转录谱分析

3.1.6 蛋白纯化

3.2 实验总结与展望

参考文献

作者简历

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摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是奇球菌属(Deinococcaceae)的代表菌种,是至今发现的抗辐射能力最强的生物之一。DNA损伤很易阻断复制叉的前进,而电离辐射会诱导产生各种形式的DNA结构损伤,这会导致各种致命的染色体畸变,从而使细胞死亡。损伤DNA的修复以及接下来停止复制叉的重启动过程对细胞生存极为重要。耐辐射球菌具有高效的DNA损伤修复机制,能够准确无误地修复由辐射引起的几百个双链DNA碎片,不造成任何突变和死亡。然而,细胞还需要一些能够重启动停止的复制叉的方式,这类方式不依赖于基因重组,而是在损伤的下游重启动复制。但是关于耐辐射球菌中停止复制叉的重启动机制还未有研究报道。
   依赖于PriA的复制重启动机制是细菌复制重启动的主要途径。在大肠杆菌中,PriA与PriB,DnaT,PriC,DnaB和DnaC等引发体蛋白共同完成停止复制叉上引发体的装载过程。根据比较基因组学的结果,发现耐辐射球菌中存在编码priA的基因,其编号为dr2606。但是耐辐射球菌在序列上不存在编码priB,priC,dnaT和dnaC的同源基因。
   为了了解priA类似基因dr2606在耐辐射球菌中的作用,我们用生物信息学的方法对dr2606基因与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中的同源物进行了序列比对。我们还通过用卡纳抗性基因代替了dr2606阅读框,构建了dr2606缺失突变株。Dr2606的突变导致菌体生长缓慢,细胞生存率急剧下降。为了检测Dr2606在DNA修复中的作用,我们对突变株进行UV和丝裂霉素处理。意外的是,耐辐射球菌的DNA修复能力没有削弱。但是,突变株的转化效率大大削弱了。这些数据表明,在耐辐射球菌中priA类似基因dr2606对停止复制叉的重启动过程并不是必需的。耐辐射球菌的不依赖于原点的复制重启动过程可能与其它细菌不同。

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