Cys突变对于GcGAST蛋白抗氧化活性的影响

摘要

赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白是一类在植物多种生理过程当中都发挥着重要作用的蛋白。2006、2010年 Eigoda等人报道该蛋白家族成员在体内具有抗氧化活性,但其详细的抗氧化机理尚不清楚。由于这些蛋白C-末端含有12个保守的半胱氨酸残基,而Cys除了稳定结构外,还可能具有抗氧化活性,因此本论文拟探讨这些Cys残基对于GcGAST蛋白抗氧化功能的影响并研究其包涵体的二级结构。
　　方法:在重组质粒构建方面,选择pET-28(a)作为原核表达载体。在此基础上,采用PCR定点突变技术,将重组质粒作为模板进行突变。这样我们可以得到十二个半胱氨酸单突变体。选择大肠杆菌BL21(DE3)作为原核表达载体,采用IPTG诱导表达。在此基础上,分别选择全细胞及包涵体,检测它们清除H2O2的能力。此外,还运用FTIR手段、吸收光谱研究GcGASA包涵体的二级结构及致密程度等。
　　结果:将突变体外送测序发现,该载体中已经成功插入了目标基因gcgasa。与此同时,12个半胱氨酸突变位点也被成功引入载体中。SDS-PAGE结果表明,包涵体在诱导表达的蛋白中大量存在。大肠杆菌工程菌抗氧化活性实验表明,表达野生型GcGASA蛋白的大肠杆菌能够耐受一定浓度的H2O2,但突变后突变体的抗氧化活性有所降低。包涵体抗氧化活性实验显示,对于野生型蛋白,它具有清除 H2O2能力,且随着蛋白浓度的提高,清除能力增强;对于突变体,即便是在较高浓度下,清除H2O2能力也不强。此外,我们通过比较DTT处理的结果发现对于野生型GcGASA,DTT处理后清除H2O2能力下降;但对于突变体却呈现出几乎相反的趋势。此外,FTIR结果表明在野生型和突变体的包涵体中,含量最多的二级结构是β-折叠。随着Cys的突变,β-折叠含量略呈下趋势,此结果与浊度实验结果基本一致。我们推测,突变体与野生型在清除H2O2及DTT处理后清除H2O2的能力显著不同可能由于蛋白的二级结构差异以及DTT处理后将一些游离的游离-SH被还原、释放出来,它们能清除H2O2所致。

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第一章 引 言

1.1 本课题研究意义

1.2 国内外研究概况

1.3 定点突变原理

1.4 包涵体的相关研究

第二章12个半胱氨酸单突变体的构建及表达

2.1 实验装置介绍

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 Cys突变对于全细胞及包涵体抗氧化的影响

3.1实验仪器和试剂

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

第四章 运用FTIR手段研究GcGASA包涵体的二级结构

4.1 实验器材及试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第五章 结束语

致谢

参考文献