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【6h】

移动通讯射频辐射对神经元基因表达谱及转录因子影响的研究

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缩略语(Abbreviations)

摘要

第一部分:移动通讯射频辐射对大鼠神经元基因表达谱的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分:移动通讯射频辐射对大鼠神经元AP-1结合活性的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述一 射频电磁场对中枢神经系统影响的研究进展

综述二 射频电磁场对视觉系统的影响和损伤阈值的探讨

就读期间发表论文

就读期间参与的科研项目

致谢(Acknowledgement)

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摘要

随着通讯事业的发展和移动通讯设备的普及,人群暴露于移动电话产生的射频电磁场(radiofrequencyelectromagneticfields,RFEMF)(频率主要为800-2000MHz)的时间和强度也不断增加,随之引起的健康问题备受瞩目。已有研究显示,RFEMF可能对中枢神经系统(centralnervesystem,CNS)、免疫系统和血液系统等许多系统产生影响。其中,由于CNS对外界刺激的反应是最敏感的,加之移动电话使用时紧贴头部,因此,脑被认为是射频辐射作用的主要靶器官。相应地,很多研究将CNS对RFEMF作用的反应和各种功能变化作为机体功能调节受影响的早期指标。尽管有流行病学调查及动物实验报道,移动电话可以引起头痛、失眠、记忆力衰退等神经功能紊乱症状,导致血脑屏障通透性和脑电图改变,引起神经细胞损伤,甚至与脑部肿瘤的发生相关,但同时也存在一些阴性报道。鉴于目前射频研究领域中使用的辐照模式、细胞类型和检测指标多样,目前的研究结果缺乏可比性。另一方面RFEMF产生生物学效应的作用机制不明,导致无法确定专一的、与损害发生相关的暴露参数。所以,迄今为止尚未得出移动电话射频辐射对人体健康影响的明确结论。作为一种可能的刺激因素,移动电话射频辐射即使没有引起宏观上明显的健康效应,细胞和分子水平的变化也可能已经发生。因此,从细胞和分子水平探讨RFEMF的生物学效应和作用机制、确定流行病学和实验研究的生物指标成为揭示射频辐射影响人体健康的有效手段。 基因转录是细胞受外界因素作用后通过系列信使传递的终端,因此发现基因转录的特异改变是最终揭示RFEMF与生物系统相互作用机制的关键之一。在射频辐射影响基因表达的研究方面,热休克蛋白、原癌基因、即刻早期基因以及一些特异性基因都有报道,但这些基因一般是根据研究者的假设事先确定的少数几个基因,故而无法全面反映射频辐射对整个基因组转录水平的影响。作为发现性科学的代表,上世纪90年代问世的基因芯片技术,为我们研究移动通讯RFEMF的生物学效应及其机制提供了有利手段,它可以克服以往对单个或某些基因研究的局限性,同时对大量不同功能的基因进行筛选,寻找RFEMF反应基因。芯片技术在具有大规模、高通量等优点的同时,尚存在一定的假阳性。为了排除芯片的假阳性,往往要通过荧光实时定量PCR(real-timequantitivepolymerasechainreaction,real-timePCR)、核糖核酸酶保护分析(RNaseprotectionassay,RPA)、反转录PCR(RTPCR)、Nortern印迹杂交(Norternblotting)等方法进行验证。 研究认为电磁场(electromagneticfields,EMF)可以影响细胞信号转导过程,而细胞信号转导的最终效应是影响转录因子的活性,转录因子活性改变又会进一步影响其下游基因的表达。有报道认为电磁场作为一种环境物理因素,可以影响AP-1、AP-2、CREB以及HSF等在内的多种转录因子的DNA结合活性。转录因子(activatorprotien-1,AP-1)是由fos(55kDa)和jun(39kDa)组成的二聚体,通过亮氨酸拉链与DNA结合。AP-1的激活是细胞信号转导研究中的经典途径之一。胞外刺激通过激活受体酪氨酸激酶、小G蛋白,进而激活MAPK的级链反应,磷酸化c-jun和c-fos,形成活化形式的AP-1转录因子转位入核。包括MAPK和PKC等在内的多种蛋白激酶可以激活AP-1,使其以不同二聚体的形式激活不同靶基因的转录。对AP-1的生物学功能的研究表明,它在细胞的增殖、分化、适应性和凋亡等许多生理过程中发挥重要作用。许多研究小组通过不同的模型还发现,激活的AP-1通过调节基因转录,参与细胞的转化和肿瘤的启动以及演进过程。此外,还有报道认为AP-1参与学习、记忆过程。凝胶阻滞迁移分析实验(electrophoresismobilityshiftassay,EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,根据结合片段和DNA片断的分子量差异通过电泳进行分离。本研究是利用EMSA方法检测经217Hz调制的GSM1800MHzRFEMF对AP-1的DNA结合活性的影响,并探讨参与此RFEMF反应的信号通路。 鉴于公众普遍担心的是移动电话使用能否引起学习能力下降、记忆力衰退等中枢神经系统功能紊乱以及肿瘤的发生,我们选择体外原代培养的大鼠皮层和海马神经元,研究移动电话RFEMF对神经元的基因表达和转录因子活性的影响。 第一部分:移动通讯射频辐射对大鼠神经元基因表达谱的影响 以体外原代培养的大鼠皮层和海马神经元为研究对象,观察217Hz调制的GSM1800MHzRFEMF对大鼠神经元基因表达谱的影响。将大鼠大脑皮层和海马神经元体外培养至第13天,随机分为两组:实验组(辐照组)和对照组(假辐照组),移入瑞士联邦工业大学(ETH)最新研制的1800MHz细胞辐照系统进行辐照或假辐照。整个辐照过程中,细胞处于37℃±0.1℃、5%CO2的孵箱中。实验选用的辐照强度比吸收率(specificabsorptionrate,SAR)为2W/kg,模式为24h间断辐照(5minfieldson/10minfieldsoff)。本课题组曾使用Affymetrix公司的大鼠神经生物基因芯片U34在1300多个候选基因中检测到大约600个表达基因,其中34个为差异表达基因(包括24个上调基因和10个下调基因)。为排除芯片结果的假阳性,本研究先后采用了RPA和real-timePCR对基因芯片筛选到的部分差异表达基因进行验证。通过对多窝和单窝SD乳鼠神经元辐照后提取的RNA的基因表达水平进行分析,确定Map2和Plp为RFEMF反应基因,发现基因表达的改变不仅与RFEMF辐照有关,还存在个体差异。我们的研究结果显示,强度为2W/kg的217Hz调制的GSM1800MHzRFEMF间断辐照24h可以引起大鼠神经元基因表达的改变,但不同个体对基因的反应性存在差异。结合RFEMF在细胞和分子水平上的同类研究,神经元显示出对射频辐射较好的反应性,可能是RFEMF反应的敏感细胞,可以作为该类研究的细胞模型。 第二部分:移动通讯射频辐射对神经元AP-1结合活性的影响 为了研究RFEMF对转录因子及其相关信号通路的影响,使用EMSA方法检测大鼠皮层和海马神经元经217Hz调制的GSM1800MHz射频辐照后,AP-1的DNA结合活性的变化。细胞培养和辐照系统与第一部分相同,辐照强度SAR为2W/kg,模式为24h间断辐照(5minfieldson/10minfieldsoff),选择15min,30min,1h,2h和4h五个不同时间点进行检测。结果显示,1800MHzRFEMF辐照前后AP-1的DNA结合活性发生变化,而且这种变化呈现时间依赖性,于辐照30min后开始升高,1h达高峰,2h开始下降,4h恢复至基础水平。为了探讨各信号通路在RFRMF诱导的AP-1激活中的作用,使用包括ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂Ⅱ(SP600125)、p38MAPK抑制剂SB203580、PKA和PKC抑制剂Staurosporine以及胞外Ca2+螯合剂EGTA、胞内Ca2+螯合剂BAPTA/AM在内的多种信号通路抑制剂处理细胞后再进行辐照。发现移动电话射频辐射诱导的AP-1结合活性的升高依赖于MAPK家族中的JNK/SAPK和p38MAPK激酶,而ERK、PKA、PKC以及细胞内外Ca2+不参与此效应。这些实验数据表明,本实验条件下1800MHzRFEMF诱导的AP-1激活具有时间依赖性,而且受JNK/SAPK和p38MAPK激酶信号通路调控。 本学位论文的主要创新: 1.本研究利用RPA及real-timePCR方法在大鼠神经元中确定Map2和Plp为RFEMF反应基因,并发现不同个体对基因的反应性存在差异。 2.我们还发现1800MHzRFEMF诱导的转录因子AP-1的激活依赖于JNK/SAPK和p38MAPK激酶信号通路,且具有时间依赖性:于辐照30min后开始升高,1h达高峰,2h开始下降,4h恢复至基础水平。从而确定AP-1为RFEMF的反应因子。 3.本研究首次将原代培养的大鼠皮层和海马神经元用于1800MHzRFEMF对功能性基因组表达和转录因子活性的研究。结果提示神经元可能是RFEMF反应的敏感细胞,可以作为该类研究的细胞模型,从而为寻找射频辐射敏感细胞提供了新的思路。

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