二氯甲烷对人正常肝细胞L02氧化损伤作用及其对LINE-1基因甲基化影响的研究

摘要

目的: 研究不同浓度的二氯甲烷作用于人正常肝细胞L02不同时间长度，导致氧化损伤及LINE-1基因甲基化改变。
　　 方法: 0-240mM二氯甲烷染毒1-4h，CCK8（改良MTT）法检测活细胞相对数和相对活力;用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活力，通过还原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量来测定GSH-Px的活力;MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbiturieacid，TBA)反应产生红色产物的显色反应，通过比色法对MDA进行定量检测;8-OHdG通过Elisa试剂盒检测;细胞中DNA经过提取和纯化后，采用焦磷酸测序法检测LINE-1基因甲基化的改变。
　　 结果:
　　 细胞毒性检测:0-240mM的DCM染毒1-4h，（染毒浓度分别为40mM、80mM、120mM、160mM、200mM、240mM，染毒时间为1h、2h、3h、4h）相同染毒时间的条件下，随着浓度的增加细胞的相对存活率降低;染毒浓度固定的条件下，随着时间的延长，细胞的相对存活率降低，存在剂量反应关系和时间效应关系。染毒1-4h的LC50分别为131.9mM、87.8mM、92.5mM和58.2mM。
　　 氧化还原状态检测:DCM染毒1h时，80mM、120mM染毒组与对照组相比细胞内SOD活力显著升高(P＜0.05)、8-OHdG浓度显著增加（P＜0.05或P＜0.01）、GSH-Px活力显著下降(P＜0.01)，120mM染毒组的MDA显著升高(P＜0.05)。染毒3h时，与对照组相比80mM和120mM染毒组的SOD值也显著升高(P＜0.05或P＜0.01)、MDA值显著升高(P＜0.01)、8-OHdG浓度显著增加(P＜0.05)。40mM、80mM、120mM染毒组的GSH-PX活力显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 DNA甲基化检测:DCM染毒3h，三个染毒剂量组和阴性对照组中LINE-1基因甲基化变化无明显差异。
　　 结论 DCM对人正常肝细胞L02具有毒性作用，随浓度升高细胞存活率下降;可以引起细胞的氧化损伤，导致SOD、MDA、GSH-Px、8-OHdG等指标的异常改变。提示DCM对人体健康产生危害的机制可能是通过氧化损伤介导的。本实验条件下，LINE-1基因甲基化情况未发生改变，DCM与表观遗传学改变的关系有待于进一步的研究。

目录

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致谢

摘要

缩略语

1 引言

1．1 二氯甲烷的用途及污染来源

1．2 二氯甲烷的急性毒性与慢性毒性

1．3 二氯甲烷与氧化损伤

1．4 二氯甲烷的遗传毒性和致突变性

1．5 二氯甲烷与LINE-1基因甲基化的潜在关系

1．6 本课题的研究目的和研究意义

2 实验材料

2．1 实验细胞来源

2．2 培养液及处理用液

2．3 检测试剂盒

2．4 仪器和设备

2．5 统计软件

3 实验方法

3．1 DCM染毒液的配制

3．2 细胞的复苏与冻存

3．3 细胞的培养与处理

3．4 细胞存活率的测定

3．5 细胞蛋白的提取

3．6 细胞内MDA、SOD、GSH-Px、8-OHdG的测定

3．7 细胞DNA的提取与纯化

3．8 焦磷酸测序方法检测LINE-1甲基化

4 实验结果

4．1 DCM对L02细胞存活率的影响

4．2 DCM对细胞中SOD、GSH-Px活性的影响

4．3 DCM对细胞中MDA、8-OHdG含量的影响

4．4 DCM对L02细胞中LINE-1基因甲基化的影响

5 讨论

6 实验结论

参考文献

综述

作者简历及在读期间所取得的科研成果