在APPSwInd小鼠中基于iTRAO技术的蛋白质组学分析研究阿尔茨海默症的早期改变

摘要

阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease)是一种神经退行性疾病，多发于70岁以上人群中，发病率随着年龄增加而上升。在目前社会逐步老龄化的当下，已经成为65岁以上人群中第四大死亡原因，是一个日趋严重的公共卫生问题。患者会出现抑郁、淡漠、烦躁、焦虑、攻击等精神症状，以及更为普遍的记忆损伤、认知障碍、执行能力损害，逐渐发展到生活不能自理，最终昏迷，死于感染等并发症。AD病因包括家族遗传，头部外伤，躯体疾病，社会心理因素等，然而发病机制尚不明确，并且缺乏早期诊断标准和早期干预手段，在中晚期阶段确诊后再进行药物干预治疗等措施难以逆转病情。所以寻找AD早期诊断标志物是一个亟待解决的事情。
　　目的：在质谱结果中探究早期AD小鼠模型中出现的生物分子方面变化，筛选出能够在两种AD模型小鼠脑部均有显著改变，并能够影响体外培养神经细胞中淀粉样蛋白前体蛋白(APP)表达的潜在AD早期生物标志物以及治疗靶点。
　　方法：使用同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）对早期AD模型小鼠J20海马部位与野生型小鼠海马区进行质谱检测，得到表达量有显著差异的蛋白。用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测在J20及双转基因小鼠APP/PSEN1海马中待筛选蛋白mRNA表达量。用Western Blot检测APP/PS EN1小鼠的不同脑区待筛选蛋白表达量与野生型小鼠中的差异。通过构建蛋白shRNA质粒进行细胞转染后敲减目的蛋白，用RT-PCR和Westren Blot验证敲减效应，并用Western Blot和细胞免疫荧光染色(ICC)进行细胞APP表达情况分析。
　　结果：用iTRAQ技术我们发现了700余种蛋白质在J20小鼠海马区有改变，其中有显著改变的有400余种，根据蛋白功能不同，将蛋白分成32类。我们发现胞外区域蛋白质以及代谢过程有关蛋白质大部分表现为增加，而突触有关蛋白全部为表现为降低。将mRNA的结果与质谱结果结合进一步分析发现，在蛋白表达和mRNA表达水平上，两种转基因小鼠是有区别的。在APP/PSEN1小鼠不同脑区进行western检测中发现Rac1蛋白在小脑区显著增加，β-spectrin在海马和皮层区域显著降低。体外细胞培养实验中发现β-spectrin蛋白的敲减对APP表达产生明显影响。
　　结论：综合上述结果，我们得到了一批潜在的AD生物标记物，并且发现了β-spectrin在AD早期对APP的转运有一定影响。

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致谢

摘要

缩略语

1．引言

1．1 阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease)

1．2 蛋白质组学与iTRAQ

1．3 AD模型小鼠

2．材料和方法

2．1 主要仪器设备和试剂

2．2 实验所用抗体

2．3 实验试剂及配制

2．4 实验方法

3．实验结果

3．1 J20小鼠海马区与野生型小鼠海马区蛋白表达量的改变

3．2 验证在改变蛋白两类AD模型小鼠海马中蛋白mRNA的表达水平

3．3 APP／PSEN1小鼠不同脑区中蛋白表达量与野生型小鼠的比较

3．4 β-spectrin在J20小鼠海马中蛋白水平改变的确认

3．5 蛋白敲减对N2A／APP细胞APP表达情况的影响

4．结论

5．讨论

参考文献

综述 蛋白质组学对阿尔茨海默症早期标记物筛选的研究进展

作者简历及在读期间所取得的科研成果