狗牙根脱水素基因的表达分析及其启动子克隆

摘要

狗牙根（Cynodon dactylon L.）属多年生禾本科植物，是应用广泛的暖季型草坪草。干旱是限制其应用的主要环境因子。水分胁迫可以诱导多种基因表达，其中脱水素基因（dehydrin gene，DHN）在植物处于干旱、脱水时大量积累并对多种环境胁迫和ABA激素均有响应。脱水素属于LEA-II（late embryogenesis abundant proteins-II）家族蛋白，是植物逆境中表达的一种响应蛋白。
　　本研究以狗牙根品种‘Tifway’（耐旱型）和‘C299’（干旱敏感型）为材料，研究脱水素基因CdDHN4在多种逆境、不同组织及不同激素处理下的表达特征。同时以狗牙根基因组为模板，通过基因步移方法克隆CdDHN45’端上游启动子序列，并在烟草中进行瞬时表达，分析该启动子的功能及调控方式。对CdDHN4基因启动子序列、表达调控以及对逆境胁迫下响应特征的研究，可为狗牙根脱水素基因抗逆机理机制的研究奠定基础。具体研究结果如下：
　　1、以‘Tifway’为材料，设置高温(45℃/40℃)、低温(10℃/5℃)、干旱、盐(200mM NaCl)和对照五个处理，研究四种环境胁迫对‘Tifway’CdDHN4的表达影响。结果表明，四种胁迫均使‘Tifway’产生生理伤害，导致脱水素基因表达量显著增加；长期胁迫(15d)，四种处理对狗牙根伤害程度依次为干旱>高盐(200mM NaCl)>低温(10℃/5℃)>高温(45℃/40℃)，CdDHN4的相对表达量呈现相同趋势，表明脱水素基因的表达可能与植物抗逆性存在相关关系。
　　2、以‘Tifway’和‘C299’为材料，分析干旱胁迫0d,5d,10d,15d下植物根、茎、叶中CdDHN4的表达变化。结果显示，对于耐旱型品种和干旱敏感型品种，干旱处理都能够诱导脱水素基因表达。处理15d时，‘Tifway’茎和叶中脱水素基因 CdDHN4的相对表达量均显著高于‘C299’，认为脱水素的积累与植物抗逆性密切相关，研究结果进一步证明了脱水素基因是干旱应答基因。
　　3、以‘Tifway’和‘C299’为材料，研究不同浓度的植物激素IAA、ABA和GA喷施处理下两品种中CdDHN4的表达差异及表达规律。结果表明，三种激素均可诱导脱水素基因的表达。浓度为5μM和50μM的ABA处理6h，12h时，耐旱型植物中的表达量显著高于干旱敏感型中的表达量。
　　4、根据已获得的狗牙根脱水素基因CdDHN4的基因组DNA编码框全长序列，通过基因步移方法克隆其5’-端上游启动子序列，并对获得的启动子进行预测分析。实验共获得CdDHN4基因启动子1242bp，命名为 CdDHN4-P，生物信息学分析发现该启动子含有作为启动子的典型元件，如转录起始位点、TATA-box和CAAT-box等；还含有许多与逆境相关的顺式作用元件，如ABRE(ABA响应元件)、TGACG-motif(茉莉酸甲酯类响应元件)、TATC-box(GA响应元件)、LTRE(低温响应元件)、光应答元件GT1-motif和ACE等。
　　5、对CdDHN4-P进行瞬时表达分析，将该启动子与GFP融合后取代植物表达载体 PBI121中CaMV35S-GUS区域，构建二元表达载体PBCdDHN4-P::GFP，并构建阳性对照 PB35S::GFP。将上述载体通过冻融法转化农杆菌 GV3101。通过农杆菌介导将两个表达载体分别转化烟草叶片，瞬时表达分析显示：注射 PBCdDHN4-P::GFP菌液的叶片，经过干旱和ABA处理后均可检测到GFP表达，说明该启动子可受多胁迫诱导调控。

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第一章 文献综述

1.1狗牙根概述

1.2植物抗逆机制

1.3植物脱水素基因研究

1.4植物启动子的研究

1.5本研究的背景、目的意义

1.6技术路线

第二章 不同胁迫处理下狗牙根脱水素基因表达分析

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3 结果与分析

2.4结论与讨论

2.5本章小结

第三章 狗牙根脱水素基因组织及激素诱导表达分析

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4结论与讨论

3.5本章小结

第四章 狗牙根CdDHN4启动子克隆及序列分析

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4结论与讨论

4.5本章小结

第五章 CdDHN4启动子瞬时表达分析

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.4结论与讨论

5.5本章小结

第六章 结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文