吲哚胺2,3-双加氧酶2对小鼠黑色素瘤生长的影响及其在肿瘤治疗中的应用研究

摘要

第一部分:IDO2表达对黑色素瘤细胞B16-BL6生物学行为的影响
　　目的：研究吲哚胺2，3-双加氧酶2(IDO2)表达对小鼠黑色素瘤细胞生物学行为的影响。
　　方法：采用IDO2-siRNA沉默小鼠黑色素肿瘤细胞株B16-BL6内IDO2的表达后，qPCR检测 IDO2 mRNA的表达水平，Western blot法检测 IDO2蛋白的表达水平，MTT法检测B16-BL6细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期，Ehrlich’s法检测细胞内犬尿氨酸生成水平，NAD+/NADH试剂盒检测细胞内NAD+水平，H2DCFDA染色检测细胞内活性氧水平。
　　结果：实时荧光定量 PCR法及 Western-blot法结果显示，沉默小鼠黑色素瘤细胞系B16-BL6中IDO2基因后，其mRNA以及蛋白的表达水平均显著下降，沉默效率达80％以上；MTT结果显示，沉默IDO2基因后的B16-BL6细胞增殖能力受到明显抑制；流式细胞术检测结果发现，IDO2基因沉默后B16-BL6细胞的G0/G1期细胞比例明显增加，而S期和 G2/M期细胞比例则明显降低，其凋亡发生率明显增加；Ehrlich’s法结果显示IDO2基因沉默减少了细胞内犬尿氨酸生成；IDO2基因沉默后NAD+生成减少，同时细胞内活性氧ROS的含量增加；补充外源性NAD+后IDO2基因沉默引起的细胞凋亡减轻。
　　结论：IDO2在B16-BL6细胞内具有酶学活性，沉默B16-BL6细胞内IDO2基因的表达可改变肿瘤细胞的生物学特性，包括：抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、使细胞周期积聚在G1期。B16-BL6细胞凋亡与IDO2沉默后NAD+的生成减少有关。
　　第二部分：B16-BL6细胞内IDO2基因表达对黑色素瘤形成生长的影响
　　目的：体内研究 B16-BL6细胞内 IDO2基因表达对小鼠黑色素瘤生长过程的影响。
　　方法：构建IDO2-shRNA质粒并进行鉴定；通过G418药物筛选建立稳定细胞系 B16-BL6/IDO2+及 B16-BL6/IDO2-，流式细胞术检测所构建细胞的绿色荧光百分比，实时荧光定量 PCR检测 IDO2 mRNA的表达水平；以B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-细胞在小鼠体内建立肿瘤模型，游标卡尺测量肿瘤大小，观察IDO2表达对黑色素瘤形成、生长的影响；流式细胞仪检测引流淋巴结内Treg和CD8+/CD8+T细胞数量、T淋巴细胞凋亡率，观察肿瘤组织内IDO2表达对引流淋巴结内免疫系统的影响。
　　结果：成功构建 IDO2-shRNA质粒；成功建立 B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-稳定细胞系：两种稳定细胞携带绿色荧光百分比达98%以上， B16-BL6/IDO2-细胞持续稳定低表达IDO2，并且经典的刺激因子IFN-?不能诱导其表达上调；与 B16-BL6/IDO2+细胞相比，接种 B16-BL6/IDO2-细胞至小鼠体内，其肿瘤形成时间延长、生长速度减慢、肿瘤重量减轻；引流淋巴结内 Treg百分比下降、CD8+T细胞数量增加、T淋巴细胞的凋亡减少。
　　结论：黑色素瘤细胞内IDO2的表达对肿瘤的生长起着促进作用，且能影响其引流淋巴结内肿瘤免疫反应。
　　第三部分：以IDO2为治疗靶标进行抗肿瘤治疗的研究
　　目的：以IDO2作为治疗靶标，研究IDO2基因表达在肿瘤治疗中的作用及其对免疫应答的影响。
　　方法：1．IDO2-shRNA及scramble-shRNA尾静脉高压注射法进行抗肿瘤治疗，游标卡尺测量肿瘤大小；流式细胞术检测各组小鼠脾脏及引流淋巴结内Treg细胞百分比、T细胞凋亡百分比，以及脾脏内树突状细胞表面共刺激分子表达情况；LDH法检测CD8+T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力；3H掺入法检测淋巴细胞抗原回忆反应；ELISA法检测血清内 TNF-?、IFN-?表达水平。2．体外沉默树突状细胞内的IDO2基因后，流式细胞术检测树突状细胞表面共刺激分子表达水平；IDO2基因沉默的树突状细胞与T细胞共培养，CFSE标记法检测异基因混合淋巴细胞反应，流式细胞术检测Treg细胞百分比。
　　结果：1．IDO2-shRNA治疗组肿瘤的形成时间较晚，肿瘤的生长速度缓慢，离体肿瘤重量明显减轻；IDO2-shRNA治疗组脾脏及引流淋巴结内的Treg细胞百分比减少，T细胞凋亡百分比下降，脾脏树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86明显增加；IDO2-shRNA治疗组小鼠体内T细胞抗原回忆能力增加，CD8+T细胞杀伤B16-BL6的能力增强,血清内TNF-?、IFN-?表达水平升高。2．体外沉默树突状细胞内 IDO2基因后，表面共刺激分子 CD80、CD86的表达百分比增加，树突状细胞刺激异基因T淋巴细胞增殖的能力增强，诱导Treg细胞的百分比下降。
　　结论：沉默荷瘤小鼠体内IDO2可以有效抑制黑色素瘤生长，提高机体的抗肿瘤免疫反应。

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引言

第一部分 IDO2表达对黑色素瘤细胞B16-BL6生物学行为的影响

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 最佳引物序列

2.2 IDO2在各小鼠肿瘤细胞内的表达情况

2.3 最佳siRNA序列筛选

2.4 IDO2-siRNA沉默B16-BL6细胞内IDO2基因

2.5 IDO2基因沉默后酶功能检测

2.6 IDO2基因表达对B16-BL6细胞生物学行为的影响

2.7 NAD+抗凋亡实验

3 讨论

第二部分 IDO2基因表达对黑色素瘤形成生长的影响

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组质粒IDO2-shRNA的鉴定

2.2 B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-稳定细胞株的建立

2.3 稳定细胞株内IDO2 mRNA的表达

2.4 稳定细胞株对IFN-?诱导反应的检测

2.5 B16-BL6细胞内IDO2表达对体内肿瘤生长的影响

2.6 B16-BL6细胞内IDO2表达对肿瘤引流淋巴结免疫环境的影响

3 讨 论

第三部分：以IDO2为治疗靶标进行抗肿瘤治疗的研究

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 IDO2-shRNA治疗黑色素瘤的抑瘤效果

2.2 IDO2-shRNA治疗对机体肿瘤免疫反应的影响

2.3 IDO2表达对小鼠树突状细胞生物学特性及功能的影响

3 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 吲哚胺2,3-双加氧酶2的生物学特性及其在免疫调节与肿瘤治疗中的作用