胰岛素口腔喷雾给药体系中几个问题的研究

摘要

糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是现代社会人类健康的主要威胁之一。据估计，在我国糖尿病患者已超过2000 万，而且呈逐年上升的趋势。国际糖尿病联合会(IDF)的资料显示，全球有约2 亿人患糖尿病，到2025 年可能超过3 亿人。而胰岛素是治疗糖尿病的主要药物，给药方式以注射为主。长期注射给药给糖尿病患者带来了诸多痛苦和不便，因此非注射给药的胰岛素制剂是目前国内外新药开发的热点。华中科技大学生物无机研究室历时十年，研发了一种有效的重组人胰岛素口腔喷雾给药体系(IES)，本文正是在此基础上，对IES 中重组人胰岛素（下称胰岛素）定量、胰岛素与功能分子间的弱相互作用以及IES 的微观结构等方面进行了较为深入的研究，主要内容如下： ①卵磷脂和苯酚会极大地干扰IES 中胰岛素的HPLC-UV 测定，因此我们采用ESI-MS 技术筛选一种能除去IES 中大量卵磷脂和苯酚的萃取剂，发现正戊醇能够满足对胰岛素定量的要求，在优化的色谱条件下得到了很好的测定结果。其中测定胰岛素的线性关系良好，线性范围是1.05~7.34U/mL，相关系数0.99936，回收率为98.1~102.5％，日间精密度RSD：0.5％(n=6)；检出限(LOD)和检出量(LOQ)分别为0.01U/mL，0.03 U/mL。通过上述测定方法，我们初步研究了IES 的储存条件和有效期，结果显示在4℃避光条件下IES 可以稳定存放一年。另外，IES 长时间存放的物理化学性质实验结果亦表明，在一年内IES 的粒径、pH 值、分散度、粘度以及折光率改变不大，完全能够保持IES 的基本性状。 ②通过ESI-MS 实验证实了在溶液中作为IES 抑菌剂的苯酚可以与胰岛素形成较为稳定的非共价复合物，按照化学计量数的比例推测在溶液中胰岛素二聚体、三聚体、四聚体以及六聚体都能与苯酚形成稳定的非共价复合物。实验中我们还发现苯酚可以增敏胰岛素的ESI-MS 检测灵敏度，这种增敏效应在不同的溶液浓度与酸度条件下都能随着苯酚的加入量的增加而增强，当溶液中苯酚与胰岛素的摩尔比超过1000:1(phenol:insulin)时，有明显的增敏作用，当这个比例达到5000:1 时，增敏作用达到最大，并且这种增敏作用对带电荷数多的胰岛素离子峰的增敏效应更强。根据上述实验现象，我们推测了可能的“质子转运机理”来解释苯酚的增敏效应。通过ESI-MS实验还检测到酪氨酸能与胰岛素以摩尔比为1:1 的比例形成较为稳定的复合物，这种非共价复合物的确证对于某些生命过程的了解或许有一定的参考作用。 采用了CD 与IR 光谱技术对胰岛素的二级结构进行了较为系统的研究，发现胰岛素溶液的酸度与浓度对胰岛素的二级结构影响都很大，并能影响胰岛素的聚集行为。苯酚以及某些酚类化合物对胰岛素二级结构的影响也很大，它们都可能成为胰岛素的变构剂，这在一定程度上也印证了ESI-MS 的实验结果。 ③通过电导率和透光率滴定的方法绘制IES 的近似体系－卵磷脂/丙二醇/PBS 的伪三元的相图，并以同样的方法得到了加药（胰岛素）体系的相图，这两个相图的主要区别在于加药体系的W/O 和O/W 区域都有所缩小。在加药体系的相图中，IES 处在O/W 区域，属于O/W 型乳液，这也证明了在IES 中作为透膜促进剂而大量使用的卵磷脂，从乳液组成上来看还起到了一般微乳体系中油相的作用，卵磷脂不但可以更好地促进胰岛素透膜，而且保持稳定的乳液性状，另外也为IES 的微观结构的研究奠定基础。 激光粒度仪和透射电镜的实验表明IES 体系中的微粒分布均匀，粒径分布为较窄的单分布，粒径分布在20nm 到260nm 的范围内，90％的粒径小于115nm，平均粒径为67.5nm，因此可将IES 归为微乳给药体系。ESI-MS、CD 光谱、31P-NMR 和TIRFM荧光成像4 种实验方法确认胰岛素与卵磷脂之间存在非共价键合的弱相互作用，胰岛素可以分布在水相和IES 微粒的表面和中心，HPLC 的测定实验说明与这些微粒结合的胰岛素分子超过三成。最后，根据以上实验结论推测出了IES 的可能的微观结构，在IES 中的微粒主要由卵磷脂形成，存在4 种主要形式，即半封闭的囊泡(SCV)、大尺寸的单室囊泡(LUV)、多层囊泡(MLV)和多室囊泡(MVV)。这为进一步研究胰岛素的透膜机制，不断提高胰岛素的生物利用度提供了有价值的参考。 ④采用FITC 标记胰岛素荧光成像的方法初步研究了HepG2 细胞和大鼠大脑皮层神经元细胞膜上的胰岛素受体(IR)与胰岛素的结合以及结合后去向，胰岛素瞬间与细胞膜上的胰岛素受体结合，而后通过细胞内化进入胞内。实验还证实了在神经元的胞体和突起（包括轴突和树突）都分布着胰岛素的受体，这些受体对于胰岛素完成脑内功能作用重大。通过FITC 标记胰岛素荧光成像方法还证实了IES 体系中大豆磷脂确有促进胰岛素透粘膜的作用，在无促进剂时，胰岛素很难透过大鼠舌下粘膜层，而在大豆磷脂的作用下，胰岛素在60min 内可以透过舌下粘膜层进入血液循环。实验表明这种简单、直观的成像方法可以成为筛选胰岛素（或其它多肽类药物）透膜（或透皮）的吸收促进剂的方法之一，为快速、定性地判断某种促进剂（或制剂）是否有透膜的能力提供了一种较为简便、可靠的方法。