厌氧氨氧化菌的富集培养及优势菌Jettenia asiatica有机营养特性研究

摘要

厌氧氨氧化细菌（Anaerobic Ammonia-Oxidizing Bacteria，简称AAOB）是地球氮素循环的重要参与者，能够在厌氧或缺氧的条件下以亚硝酸盐为电子受体氧化铵盐，并最终产生氮气和硝酸盐。得益于该菌的自养性和厌氧性，厌氧氨氧化工艺相比传统生物脱氮技术可以降低能耗，近年来广受关注。一直以来人们认为AAOB遵循化能自养型生长方式，但是近年来关于AAOB基因组学等研究的结果表明：AAOB中的Candidatus Kuenenia stuttgartiensi、Candidatus Brocadia fulgidaa、Candidatus Anammoxoglobus propionicus等具有有机营养型代谢的能力。本研究利用膨胀污泥颗粒床（Expanded Granular Sludge Bed，EGSB）反应器富集出以CandidatusJettenia asiatica（J.asiatica）为优势菌种的AAOB菌群；考察了小分子有机物对厌氧氨氧化（Anaerobic Ammonium Oxidation, ANMMOX）富集培养物活性及生长的影响；借助于13C和15N稳定同位素示踪技术与纳米二次离子探针技术，分析了J.asiatica对乙酸、丙酸和氨氮的吸收和转化特点，对J. asiatica代谢这三种物质的代谢途径进行了探讨。
　　研究以ANAMMOX污泥为接种物，在HRT5.5~3 h、温度33±2℃、碳酸氢盐为唯一碳源等条件下启动EGSB反应器，对AAOB进行富集。EGSB达到稳定运行后，平均NH4+-N与NO2--N去除率分别为92.13％和92.12%，稳定运行期间的最高总氮负荷为6.59kgN/（m3·d），最大总氮去除负荷为5.84 kgN/（m3·d）。获得的ANAMMOX富集培养物呈亮红色、颗粒态，颗粒的形状不规则且由许多球状的亚单位组成，内部微生物的形态以球菌为主，菌体形态相对一致，直径为0.8~1.2μm。FISH、qPCR及克隆测序结果表明，接种物通过富集培养，其AAOB的相对丰度由57.69%提高到83.32%，AAOB的特征基因hzo拷贝数由0.49 hzo拷贝/16S总菌拷贝提高到0.83 hzo拷贝/16S总菌拷贝，ANAMMOX富集培养物中的优势菌种为J.asiatica。
　　分别以乙酸、丙酸和丙氨酸为碳源对以J.asiatica为优势菌种ANAMMOX富集培养物的脱氮活性及增殖特性进行研究，结果表明，低浓度的乙酸盐（≤30 mg/L）和丙酸盐（≤50 mg/L）对AAOB脱氮过程无明显影响（P>0.05）。qPCR结果清晰地表明了以J. asiatica为优势菌种的ANAMMOX富集培养物能够在低浓度乙酸盐和丙酸盐条件下以较低的生长速率生长。在较高浓度的乙酸盐（≥200 mg/L）和丙酸盐（≥400 mg/L）培养条件下，NH4+-N去除率显著下降（P<0.001）。
　　采用13C和15N稳定同位素示踪技术与纳米二次离子探针技术，在单细胞水平上分析J.asiatica对乙酸、丙酸和氨氮的吸收和转化特点，结果表明，乙酸盐和丙酸盐均可被J.asiatica吸收转化，而且能刺激了J.asiatica对无机碳源HCO3-的吸收。研究发现，J.asiatica对氨氮（15N标记）的吸收非常迅速，可在20 min内达到峰值，乙酸盐或丙酸盐的加入可以显著促进了J.asiatica对15NH4+-N的吸收。分析认为，这一促进作用是通过增加电子供体，强化亚硝酸盐和硝酸盐的还原反应而实现的。

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第1章 绪 论

1.1 课题来源

1.2 课题背景及研究的目的和意义

1.3 厌氧氨氧化菌的研究进展

1.4 代表性厌氧氨氧化工艺研究

1.5 纳米二次离子探针技术在环境微生物领域的应用

1.6主要研究内容与技术路线

第2章 实验材料与方法

2.1 实验装置与操作条件

2.2接种污泥与试验废水

2.3 实验仪器设备及试剂

2.4 培养实验

2.5 检测方法

2.6 数据统计与分析方法

第3章 厌氧氨氧化菌的富集培养

3.1 引言

3.2 EGSB反应器的运行效能

3.3富集培养前后优势种群的变化

3.4 ANAMMOX富集培养物中AAOB的相对丰度分析

3.5 ANAMMOX富集培养物形态观察

3.6 本章小结

第4章 小分子有机物对ANAMMOX富集培养物活性及生长的影响

4.1 引言

4.2 乙酸盐对ANAMMOX富集培养物的活性及生长的影响

4.3 丙酸盐对ANAMMOX富集培养物的活性及生长的影响

4.4 丙氨酸对ANAMMOX富集培养物活性的影响

4.5 本章小结

第5章厌氧氨氧化菌Jettenia asiatica小分子有机物营养特性研究

5.1引言

5.2厌氧氨氧化菌Jettenia asiatica细胞的辨识

5.3Jettenia asiatica对小分子有机物的吸收

5.4有机物作用下的Jettenia asiatica对氨氮的吸收与转化

5.5Jettenia asiatica对小分子有机物的代谢途径分析

5.5 本章小结

结论

创新点：

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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致谢

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