外源香蕉枯萎病菌基因小分子RNA对其生长发育的影响

摘要

香蕉枯萎病危害着我国和世界香蕉产业的健康发展，是亟待解决的世界性难题。寄主植物诱导基因沉默技术是培育广谱和持久抗病性的香蕉新种质的有效途径之一。前期通过对香蕉枯萎病菌早期发育蛋白质组和24种营养亲和型病原菌基因组的深入分析，发现麦角甾醇生物合成途径FoERG6、FoERG11、FoERG13和FoERG25蛋白对病原菌的生长发育至关重要，是极佳的防控靶标位点。其中FoERG6蛋白有两个同源基因编码即FoERG6A、FoERG6B，FoERG11蛋白有三个同源基因编码即FoERG11A、FoERG11B、FoERG11C，FoERG13蛋白有三个同源基因编码即FoERG13A、FoERG13B、FoERG13C，FoERG25蛋白有三个同源基因编码即 FoERG25A、FoERG25B、FoERG25C。本研究主要通过从体外外饲靶标基因小分子RNA处理香蕉枯萎病菌热带四号生理小种（Foc TR4）和一号生理小种（Foc Race1），探索其抑菌效果及相关分子机理，为香蕉抗病分子育种提供理论依据。获得如下结果：
　　1.成功构建了分别表达 Foc TR4 ERG6、ERG11、ERG13和 ERG25双链 RNA（dsRNA）的原核表达载体和香蕉遗传转化表达载体
　　均以“正向片段+内含子+反向片段的”的形式,将四个靶标基因的特异干涉片段构建了由prrn强启动子驱动、能在大肠杆菌HT115（RNaseIII缺失体）中表达完整dsRNA的载体DI-T-P中；以及由Ubi强启动子驱动，适合在香蕉中表达dsRNA的载体pYL-RNAi中。通过定量PCR检测了阳性菌株中上述基因dsRNA的表达量；通过寄主植物诱导基因沉默技术，获得了含有 FoERG6和 FoERG11干涉片段的转基因香蕉植株（由博士生窦同心完成）。
　　2．四个靶标蛋白编码基因的dsRNA对Foc TR4和Foc Race1病原菌的早期发育都有显著的抑制效果
　　提取含靶标基因dsRNA的阳性菌株总RNA，在体外对Foc TR4和Foc Race1进行外饲处理，加入总RNA的浓度为500 ug/ul，孢子处理浓度为1×105conidia/ml，分别在12、24和48小时时间点取样观察，发现四个靶标基因的dsRNA对Foc TR4和 Foc Race1早期发育均表现出显著的抑制作用，其中 FoERG11和 FoERG25 dsRNA的抑菌作用优于FoERG6和FoERG13,并说明靶标蛋白编码基因序列在香蕉枯萎病菌中高度保守。
　　3.经靶标基因dsRNA处理后Foc TR4中相应的靶标基因、麦角甾醇和胆固醇生物合成途径相关基因的表达谱变化
　　Foc TR4经靶标基因dsRNA处理0和12小时后，运用定量PCR对靶标基因、麦角甾醇和胆固醇生物合成途径相关基因的表达量进行了分析。发现自身基因都显著下调，其他麦角甾醇途径中的基因即ERG3A、ERG3B、ERG4、ERG6A、ERG6B、ERG11A、ERG11B、ERG11C、ERG13、ERG11A、ERG11B、ERG11C和ERG25均显著下调表达，胆固醇合成途径中的基因即TGL、ARE1A和ARE1B均显著上调表达。说明外饲靶标蛋白编码基因的dsRNA，都能有效抑制四个蛋白编码的靶标基因的表达，同时也影响到了麦角甾醇生物合成途径中其它基因和胆固醇合成途径相关基因的表达。
　　4.高通量测序分析转基因香蕉植株中小分子RNA的表达
　　课题组其他成员运用寄主植物诱导基因沉默技术，就是让香蕉表达 dsRNA来沉默入侵病菌细胞内的靶标基因，以达到干扰病菌麦角甾醇生物合成、破坏其生物膜功能的目的。首先获得了对香蕉枯萎病有一定广谱抗性的新种质 RNAi-FoERG6和 RNAi-FoERG11。本研究选择野生型和四个不同转基因株系（RNAi-ERG6-8、RNAi-ERG6-36、RNAi-ERG11-43、RNAi-ERG11-52）进行小分子 RNA测序分析，靶标基因小分子 RNA（siRNAs）的表达量占香蕉总量的1.96％、2.02%、5.47%和6.20%。此外，外饲含靶标基因siRNA的转基因香蕉汁液，也能有效抑制Foc TR4的早期发育。说明在转基因香蕉异源表达枯萎病菌Foc TR4FoERG6和FoERG11基因的siRNAs能显著提高它们的抗病性。
　　综上所述，本研究证明Foc TR4的ERGs基因序列在香蕉枯萎病菌小种间非常保守；Foc TR4能够吸收外饲的完整dsRNA和siRNA，并引发体内的RNAi沉默机制；再次说明抑制香蕉枯萎病菌麦角甾醇生物合成途径，干扰其生物膜功能，能有效抑制病原菌的生长。由于ERGs基因在香蕉枯萎病菌中高度保守，且为真菌特有代谢途径的合成基因，寄主植物诱导基因沉默方法靶标ERGs基因在香蕉抗病育种中具有很强的广谱性和安全性。此结果为培育广谱、持久抗病香蕉新种质、解决生产实践中抗病基因资源缺乏的问题开拓了新的策略。

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1前言

1.1香蕉与香蕉枯萎病

1.2 香蕉枯萎病的危害

1.3 香蕉枯萎病的防治

1.4 真菌麦角甾醇的生物合成途径及本研究中相关目的基因

1.5基于高通量测序的香蕉小分子RNA分析

1.6研究目的及意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2 菌株与载体

2.3 PCR扩增引物

2.4 主要仪器设备

2.5 主要试剂、药品

2.6 主要溶液及试剂配方

2.7生物信息学分析工具

2.8载体的构建及转化

2.9 dsRNA的表达

2.10 总RNA的提取

2.11相关阳性菌株中 mRNA 的相对表达量

2.12在体外靶标蛋白编码基因的dsRNA对病原菌的抑菌试验

2.13麦角甾醇及胆固醇代谢途径中相关基因的mRNA水平的表达分析

2.14 转基因香蕉小分子RNA的测序分析

2.15Foc TR4对转基因香蕉中靶基因siRNA吸收的效果检测

2.16 数据处理与分析

3.结果与分析

3.1 香蕉枯萎病菌中四个靶标蛋白编码基因的生物信息学分析

3.2 相关载体的构建

3.3大肠杆菌HT115菌株中四个靶标蛋白编码基因的dsRNA水平检测

3.4 Foc TR4及Foc race1早期发育的抑菌试验

3.5麦角甾醇及胆固醇代谢途径中相关基因的mRNA水平的表达分析

3.6转基因香蕉中小分子RNA测序

3.7 Foc TR4对转基因香蕉中靶基因siRNA吸收的效果检测

4讨论

4.1 抑菌试验及麦角甾醇生物合成途径中相关基因分析

4.2 小分子RNA在植物生长发育中的重要性

4.3宿主诱导的基因沉默

致谢

参考文献