猪-猴异种移植动物模型生物匹配性前导实验

摘要

免疫抑制剂的不断问世大大改善了移植后的免疫排斥反应，使临床移植得到了快速的发展。然而供移植器官来源短缺的困难成为目前器官移植界所面临的最大的难题。猪到人异种移植为解决这个问题提供了一个新的方向，但是由于猪和人在进化过程中是远源物种的关系，所以两者在生理、病理以至基因蛋白水平上都存在巨大差异，这必将导致在异种移植中出现比同种异体移植强烈和复杂的排斥反应。揭示异种移植的排斥机制和寻找有效的方法预防与治疗是将异种移植向临床应用推进的重要课题，需要开展大量临床前的基础理论研究。猪一猴的移植模型是研究猪-人异种移植的重要基础。尽管作为受者的猕猴在生物学和生理功能上与人比较接近，但两者间仍然存在一定差异，为了从中得到更有指导意义的结果，有必要了解两物种的基因差异。 本研究使用Illumina Sentrix Human-6全基因表达谱芯片比较了人和猕猴肝脏、脾脏以及外周血的基因表达，实验结果显示：微阵列检测三种组织的结果共有6000多个基因表达。从中选择24个与缺血再灌注损伤相关的基因进行分析，发现两物种间基因表达的一致率是82.36％；52个与免疫相关的基因，一致率是72.92％；30个与细胞周期相关的基因，一致率是87.01％。应用人的基因芯片检测到人与猕猴mRNA表达的一致率是76.98％。结果提示：人与猕猴基因的差异比我们以前想象的大，人的基因芯片不适合用于检测猕猴的样品。在猪-猴的移植模型中分析实验结果时必须要考虑人与猕猴的基因差异。异种移植不仅要克服免疫排斥的问题，还要考虑到移植后的脏器是否能够行使正常的生理功能，从而达到移植受者的需求，即移植脏器的功能匹配。我国是世界上肝脏疾病发病率最高的国家之一，各类肝炎、肝硬化、肝癌、先天性与代谢性肝病等最终反展为终末期肝病，药物治疗和一般的外科手术难以奏效，因此对肝脏移植有很大的需求。供器官短缺是移植界所面临的共同问题。中国版纳微型猪近交系一世界上首个大型哺乳动物近交系一，迄今为止，已连续近交到第19世代，近交系数高达98.3％，是最适合异种移植的供体动物<'[1]>。异种移植除了要解决免疫排斥的问题，还要考虑移植后供器官能否行使正常的生理功能。猪．人异种肝脏移植后，长期免疫抑制剂的使用，因此有必要对肝脏代谢免疫抑制剂的生理功能是否匹配也需要探讨。 本研究还应用高效液相色谱法(HPLC)检测人、普通家猪和版纳微型猪(Banna Minipig Inbred Line，BMI)红细胞内硫嘌呤甲基转移酶活性(TPMT)。TPMT是嘌呤类免疫抑制剂如硫唑嘌呤Azathioprine(AZP)代谢的关键酶，其活性对嘌呤类药物用量和疗效发挥着至关重要的作用。TPMT以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)为特异性的甲基供体，催化6-MP生成6-MMP。因为红细胞内TPMT活性与肝脏有良好相关性，通过红细胞中6-MMP浓度的检测，可评估肝组织中该酶的活性，所以实验通过HPLC法检测红细胞内6-甲基-巯基嘌呤(6-MMP)浓度，换算出红细胞中TPMT活性，预测肝脏中该酶活性，并比较人、普通家猪和版纳猪三者间进行比较。实验结果显示：HPLC法的标准曲线在6.25～100rlmol／ml范围内有良好线性，方法回收率为98.08％～100.05％，萃取回收率为88.1％～92.4％，秕内RSD为1.0％～1.5％，批间RSD为1.0％～4.4％。以上提示本方法简便、精确，适用于临床和科研中测定人和猪红细胞和肝组织TPMT活性。计算结果显示人TPMT活性为(17.45±3.62)U，家猪TPMT活性为(7.65±1.35)U，版纳猪TPMT活性为(8.73士1.55)U。BMI和普通家猪红细胞表达TPMT活性约为人的1/2。结果提示：在使用嘌呤类免疫抑制剂时，需根据患者TPMT活性调整免疫抑制剂的用量。将来的猪到人异种肝移植后，应适当减少经TPMT代谢的药物用量，避免毒副作用的发生。

目录

声明

前言

第一部分应用人表达谱芯片检测猕猴组织基因表达的可行性探讨

第二部分人和猪红细胞硫嘌呤甲基转移酶活性及差异性分析

全文总结

综述基因芯片技术在称植器官缺血再灌注损伤研究中的应用

主要中英文对照表

致谢