呼吸道合胞病毒亚单位疫苗的研究

摘要

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）属副黏病毒科，肺炎病毒属，为非节段性的负链RNA病毒。RSV基因组有15，222个核苷酸，主要编码10个特异性蛋白，其中膜表面的融合蛋白F和粘附蛋白G是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒表面抗原，是疫苗研究开发的重要内容。呼吸道合胞病毒（RSV）广泛流行于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原微生物之一。世界卫生组织（WHO）已将RSV疫苗列为全球疫苗计划中优先发展的疫苗之一。RSV疫苗研制虽已有40年历史，但至今尚无被批准使用．的疫苗。 为此，本研究利用杆状病毒昆虫表达系统表达了RSV全长的F、G蛋白，免疫Balb/c小鼠，评价了F和G全长蛋白疫苗的免疫原性和有效性。运用生物信息学软件选择F205～223，255～278，G142～204位氨基酸作为研究对象，表达并纯化了F—G融合表位蛋白。该研究为进一步研制适合我国的RSV疫苗奠定了试验基础。 RSV F和G全长重组蛋白疫苗的质粒构建、表达和纯化目的表达并纯化RSV Long株F和G全长蛋白。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）克隆了RSV A型Long株的全长F和G基因，构建了F—pFastHT A和G—pFastHT A质粒。将阳性重组质粒分别转化DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒质粒F—Bacmid和G—Bacmid。将其转染昆虫细胞，成功包装了含有目的片段的重组杆状病毒，采用Ni2+离子亲和层析柱纯化了接毒细胞的表达产物。进行SDS—PAGE电泳、间接免疫荧光和Western—blot试验鉴定重组蛋白。结果目的蛋白F和G在昆虫细胞中有特异性表达， Ni2+离子亲和层析柱能够很好的吸附重组目的蛋白。结论成功克隆了RSV F和G基因，并在Sf9昆虫细胞中获得表达。Ni2+离子亲和层析法纯化目的蛋白的纯度达85％以上，可用于免疫Balb/c小鼠。 RSV F和G全长重组蛋白和表位肽疫苗免疫效果的研究目的检测RSV F和G蛋白候选疫苗的免疫原性和安全性。方法选用Mf59分别与F、G蛋白配制疫苗滴鼻免疫Balb/c小鼠；弗氏佐剂与F和G蛋白配制疫苗肌肉注射免疫Balb/c小鼠做为对照。分别采用间接ELISA法和微量中和试验检测免疫鼠血清特异性IgG和中和抗体效价；间接ELISA法检测免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性IgG和SIgA抗体效价；MTT法检测免疫鼠脾淋巴细胞增殖：ELISPOT法检测免疫鼠脾脏淋巴细胞γ—IFN、IL—2、IL—4分泌。结果经杆状病毒昆虫表达系统表达的RSV F和G全长蛋白在Balb/c小鼠体内诱导产生了高滴度的血清IgG抗体、中和抗体和肺局部抗体，其中F蛋白疫苗诱导产生了平衡的IgG1/IgG2a。结论RSV F蛋白可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫：G蛋白疫苗只刺激机体产生体液免疫，并引起Th2优势应答。 RSV F—G表位肽疫苗的质粒构建、表达及纯化目的选择能同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫并诱导平衡的Th1/Th2应答的RSV表位蛋白。方法运用生物信息学软件预测F和G蛋白的空间结构，并查看资料寻找F和G蛋白的抗原表位。选择F205～223，255～278，G142～204位氨基酸作为研究对象，合成编码这两段表位的基因，采用重叠PCR将编码F和G两段表位的基因连接，杆状病毒昆虫表达系统表达F—G融合表位肽蛋白，Ni2+亲和层析纯化目的蛋白。结果融合表位蛋白F—G在昆虫细胞中有特异性表达，Ni2+离子亲和层析柱能够很好的吸附重组目的蛋白。结论成功克隆了RSV F—G融合表位基因，并在Sf9昆虫细胞中获得表达。Ni2+离子亲和层析法纯化目的蛋白的纯度达85％以上。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表、图表目录

声明

引 言

1.RSV的生物学特性和流行病学

2.RSV感染的免疫病理

3.RSV感染的治疗

4.预防RSV感染的疫苗研究

4.1福尔马林灭活疫苗

4.2亚单位疫苗

4.3减毒活疫苗

4.4病毒载体疫苗

4.5基因工程疫苗

4.6核酸疫苗

5.杆状病毒表达系统

5.1杆状病毒的生物学特性

5.2杆状病毒表达系统组成

5.3杆状病毒昆虫表达系统的原理

5.4杆状病毒昆虫表达系统技术路线

6.本研究的目的和意义

第一章RSV F和G全长蛋白疫苗的质粒构建、表达和纯化

1.材料

1.1毒株和细胞

1.2主要药品与试剂

1.3引物设计

1.4试验仪器

1.5溶液的配置

1.6分子生物学分析软件

2.方法

2.1呼吸道合胞病毒的培养

2.2总提RSV病毒RNA

2.3 RT-PCR

2.4目的片段与T载体的连接

2.5目的片段与表达载体连接

2.6阳性质粒的同源重组

2.7同源重组质粒的菌落PCR鉴定

2.8分离重组质粒F-Bacmid和G-Baemid DNA

2.9分析重组质粒Bacmid DNA

2.10 Sf9昆虫细胞培养

2.11细胞转染

2.12 收获重组杆状病毒

2.13 PCR鉴定重组杆状病毒

2.14空斑试验测定病毒效价

2.15重组杆状病毒的扩增

2.16重组蛋白的表达

2.17重组蛋白表达的检测

2.18 Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白

3.结果

3.1 Vero细胞培养RSV Long的细胞病变

3.2 RT-PCR扩增F和G基因片段的电泳结果

3.3目的片段连T载体菌落PCR和酶切鉴定结果

3.4目的片段与pFastHT A载体连接菌落PCR和酶切鉴定结果

3.5同源重组菌落PCR结果

3.6分析重组质粒Bacmid DNA结果

3.7转染Sf9细胞结果

3.8空斑试验结果

3.9蛋白表达结果

3.10 Ni2+亲和层析纯化目的蛋白结果

4.小结与讨论

第二章RSV F和G全长蛋白疫苗免疫效果的研究

1.材料

1.1毒株和细胞

1.2主要试剂与仪器

1.3实验动物

1.4主要试剂的配制

2. 方法

2.1 RSV A型Long株病毒的培养

2.2 RSV Long病毒滴度测定

2.3纯化的F、G蛋白候选疫苗免疫动物

2.4免疫鼠血清特异性IgG抗体效价检测

2.5免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性IgG和SIgA检测

2.6免疫鼠血清特异性IgG1和IgG2a检测

2.7免疫鼠血清中和抗体滴度检测

2.8脾脏淋巴细胞制悬液备

2.9免疫鼠T淋巴细胞增殖检测

2.10脾脏细胞γ-IFN、IL-2、IL-4分泌的检测

2.11数据处理

3.结果

3.1 RSV病毒滴度

3.2免疫鼠血清抗体效价

3.3免疫鼠肺、鼻灌洗液IgG抗体效价

3.4免疫鼠肺、鼻灌洗液SIgA抗体效价

3.5免疫鼠血清特异性IgG1和IgG2a效价

3.6免疫鼠血清中和抗体滴度

3.7免疫鼠T淋巴细胞增殖检测结果

3.8免疫鼠脾脏分泌γ-IFN、IL-2、IL-4的淋巴细胞数

4.小结与讨论

4.1体液免疫效果评价

4.2细胞免疫效果评价

4.3黏膜免疫效果评价

第三章RSV F-G蛋白表位肽疫苗的质粒构建、表达及纯化

1.材料

1.1生物信息学软件预测F和G蛋白表位

1.2 F和G蛋白表位基因序列的合成

1.3质粒

1.4引物设计

2.方法

2.1 PCR扩增F和G串联表位基因

2.2重叠PCR扩增F-G串联表位基因

2.3重组质粒F-G-T、F-G-pFastHT A的酶切鉴定

3.结果

3.1 PCR扩增F串联表位基因和G片段串联表位基因电泳结果

3.2重叠PCR扩增F-G串联表位基因的电泳结果

3.3 F-G串联表位基因连T载体菌落PCR和双酶切结果

3.4 F-G串联表位基因与pFastHT A连切接菌落PCR和双酶切结果

3.5同源重组菌落PCR结果

3.6分析重组质粒Bacmid DNA结果

3.7转染Sf9细胞结果

3.8空斑试验结果

3.9蛋白表达结果

3.10目的蛋白纯化结果

4.小结与与讨论

全文讨论

结 论

致谢

参考文献

作者简介