重组人精子特异性乳酸脱氢酶抗原的制备及其在不育症自身抗体检测中的应用

摘要

目的：(1)原核表达制备重组人精子特异性乳酸脱氢酶(rhLDH—C4)抗原。(2)以rhLDH—C4为包被抗原，建立人血清抗LDH—C4抗体(IgG型)检测的间接ELISA方法，为人血清抗精子抗体(ASA)的检测及免疫不育症的诊断提供新的实验方法。(3)探讨人血清抗LDH-CA抗体IgG与不育症的关系。 方法：(1)应用本室构建的pET一28a(+)一hLDH—C重组质粒，转化大肠杆菌Ecol．BL21(DE3)plysS；经菌液PCR及酶切电泳鉴定后，用IPTG诱导rhLDH—C4蛋白的可溶性表达，经Ni+一NTA亲和层析法一步纯化，制备rhLDH-C4抗原；SDS—PAGE鉴定重组蛋白的纯度；乳酸脱氢酶同工酶活性染色检测重组蛋白的酶活性。(2)应用Westernblotting从不育患者血清标本中筛选出一例抗LDH—C4抗体阳性的血清标本作为阳性对照，以25例处女血清标本OD测定值确定ELISA的判定临界值(cut—off)，建立间接ELISA方法，并优化其它检测参数。(3)应用该ELISA方法，分别检测74例正常男女(生育组)和177例不明原因不育男女(不育组)血清标本中的抗LDH—C4抗体(IgG型)的水平。 结果：(1)1000ml菌液经诱导纯化后，得rhLDH—c4蛋白约1．5mg：纯化的rhLDH—c4在SDS-PAGE电泳中仅显示一条区带；乳酸脱氢酶同工酶活性染色显示rhLDH-C4活性区带位于LDH一4附近。(2)ELISA检测参数的确定：rhLDH-C4抗原最适包被浓度为1μ／ml，判定临界值(cut-off)为O．120。(3)血清标本ELISA检测结果：不育组阳性率显著高于正常生育组(30．51％对9．46％，PO．05)。 结论：(D成功地制备了高纯度的rhLDH—C4抗原，该蛋白具有类似天然乳酸脱氢酶同工酶的酶活性。(2)首次建立了人血清抗LDH-C4抗体(IgG型)检测的间接ELISA方法，该方法具有高度的敏感性及特异性。(3)人血清抗LDH-C4抗体IgG与不明原因不育症关系密切。

目录

英文缩略词表

前言

第一部分重组人精子特异性乳酸脱氢酶抗原的制备

第二部分不育患者血清抗人精子特异性乳酸脱氢酶抗体的检测

小结

参考文献

综述:抗精子抗体与免疫不育的研究进展

致谢

附录免抗人精子特异性乳酸脱氢酶抗血清的制备