以木糖结晶母液为原料联产木糖和乙醇工艺的建立与优化

摘要

木糖结晶母液是结晶木糖生产过程中的主要副产物，主要成分为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖。进一步综合利用木糖结晶母液，对以玉米芯为主要原料生产木糖和木糖醇工业体系的健康发展，改善其经济效益并提升其环境友好，具有重要产业需求与应用价值。为此，本文探索运用新构建菌种，生物发酵转化木糖结晶母液的主要单糖（木糖除外）为乙醇并同步回收其中的木糖，可为木糖结晶母液综合加工形成新的技术方案。本文获得如下有益结果: (1)木糖不利用产乙醇大肠杆菌的单糖代谢特征解析 对重组大肠杆菌B0013-2012PA运输及代谢木糖特征进行了系列评价，确认该菌株在木糖为唯一碳源的M9平板上不生长，在木糖和葡萄糖混合碳源的液体M9培养基中，木糖未被利用，细胞破碎液分析显示培养基中的木糖未运输至胞内。 对重组大肠杆菌B0013-2012PA代谢利用葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖生长特征进行了系列评价。在葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖为唯一碳源的M9平板上均可生长。好氧摇瓶培养条件下，重组大肠杆菌B0013-2012PA以葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖为唯一碳源的M9液体培养基中，菌体生长速率分别为0.28g/(L·h)、0.26g/(L·h)、0.31g/(L·h)，比生长速率分别为0.243h-1、0.296h-1、0.237h-1。 对重组大肠杆菌B0013-2012PA代谢利用葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖厌氧发酵产乙醇的特征进行了系列评价。好氧培养12h获得高活性菌体后，厌氧发酵葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖产乙醇的速率分别为0.48g/(L·h)、0.39g/(L·h)、0.31g/(L·h)。 考察了高浓度木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖结晶母液和乙醇对该菌株生长抑制情况，其最小抑制浓度分别为13.7％、16.3％、11.9％、15.6％、14.1％和4.3％。结合以木糖结晶母液为原料联产木糖和乙醇的工艺特征，考察了重组大肠杆菌B0013-2012PA厌氧发酵条件下对木糖、木糖结晶母液和乙醇的耐受情况，其最高耐受浓度分别为16.7％、14.6％和6.3％。 (2)乙醇发酵工艺的建立与优化。 摇瓶条件下对木糖结晶母液为原料联产木糖和乙醇的工艺参数进行了系列评价，确定的最优培养基如下:M9基础培养基添加终浓度2.0g/L的氯化铵和5.0g/L的酵母膏，木糖结晶母液的起始添加量为发酵体积的1.5％;确定的最优工艺为好氧培养条件下，37℃，200r/min，培养12h;转入静置培养后，40℃培养至发酵结束。在最优条件下，厌氧产乙醇阶段木糖结晶母液补加量为发酵体积的10％，菌株消耗14.1g/L葡萄糖、19.4g/L阿拉伯糖和5.6g/L葡萄糖，生成乙醇18.0g/L，混合糖到乙醇转化率为45.9％，乙醇合成速率为1.19g/(L·h)，较M9培养基原始发酵工艺条件下提高了3.5倍(对照的乙醇合成速率为0.34g/(L·h));发酵液中保留的木糖含量为33.0g/L;木糖占发酵液中总糖比例由57.0％上升至97.1％，有助于木糖作为产品的分离提取。 结合摇瓶条件下确定的培养基和发酵工艺参数，在5L发酵罐体系下，采用两阶段分批补料工艺，木糖结晶母液起始添加量为发酵体积的10％，37℃好氧培养菌体约8h，然后转入厌氧乙醇发酵阶段，分别补加三次木糖结晶母液共计900mL，40℃发酵32h，乙醇积累量和合成速率分别为51.0g/L和1.59g/(L·h);除木糖外，其他总糖到乙醇的转化率为47.2％;木糖的积累量为113g/L，木糖占发酵液中总糖比例为98.2％。实验结果表明，木糖结晶母液为原料经重组大肠杆菌B0013-2012PA发酵可以实现木糖和乙醇的联产。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1木糖结晶母液的来源

1．2木糖结晶母液的组成成分

1．3木糖结晶母液的应用现状

1．4生物乙醇的发展现状

1．5影响微生物发酵生产乙醇的因素

1．6论文研究的意义和主要内容

2材料与方法

2．1药品与材料

2．1．1菌株

2．1．2主要试剂

2．1．3主要仪器设备

2．1．4相关试剂及培养基的配制

2．2实验方法

2．2．1生物传感仪测定葡萄糖和乙醇

2．2．2 HPLC测定单糖

2．2．3干燥法测定固形物含量

2．2．4菌株的筛选

2．2．5菌株的生长曲线测定

2．2．6不同碳源乙醇发酵差异分析

2．2．7菌株生长的糖和乙醇抑制实验

2．2．8高糖和高乙醇浓度对发酵的影响

2．2．9两阶段发酵工艺的确定

2．2．10培养基碳源和氮源优化

2．2．11两阶段温度优化

2．2．12摇瓶发酵工艺验证

2．2．13木糖结晶母液的发酵罐小试

3结果与讨论

3．1木糖结晶母液的组分分析

3．2．1菌株的筛选

3．2．2菌株的生长曲线测定

3．2．3不同碳源乙醇发酵差异

3．2．4菌株生长的糖和乙醇抑制实验

3．2．5高糖和高乙醇浓度对发酵的影响

3．3．1两阶段发酵工艺确定

3．3．2培养基碳源和氮源优化

3．3．3两阶段温度优化

3．3．4摇瓶发酵工艺验证

3．3．5木糖结晶母液的发酵罐小试

4结论

4．1全文总结

4．2论文的创新点

4．3论文的不足之处

5 展望

参考文献

7攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢