家蚕表达人促红细胞生成素(rhEPO)口服药物的研究

摘要

为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素(rhEPO)口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性，本论文使用Bac-to-Bac系统构建重组人促红细胞生成素家蚕杆状病毒(vBm-rhEPO)，并使用实时荧光定量PCR的方法检测重组病毒滴度。经SDS-PAGE和WesternBlotting鉴定，家蚕卵巢上皮细胞（BmNcell）、五龄幼虫和蛹分别接种重组病毒vBm-rhEPO发病后，均成功表达rhEPO(BmrhEPO)蛋白，且分子量大小一致，约为25kDa。将接种vBm-rhEPO后发病的蚕蛹匀浆、冻干制成BmrhEPO蚕蛹冻干粉，经ELISA检测，BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO蛋白的含量约为8382IU/g。通过分析BmrhEPO对人红系白血病细胞(TF-1cell)生长增殖的促进作用，使用MTT法检测到BmrhEPO具有与rhEPO(中国仓鼠卵巢细胞(CHOcell)表达)相似的体外生物学活性，相同浓度条件下，BmrhEPO的体外生物学活性高于rhEPO(CHOcell)，计算得出，BmrhEPO的半数有效浓度EC50值为0.36IU/mL，略低于rhEPO(CHOcell)的EC50值0.39IU/mL。小鼠口服BmrhEPO蚕蛹冻干粉急性毒性实验显示，BmrhEPO蚕蛹冻干粉基本无毒，最大耐受剂量大于147882IU/kg。使用腺嘌呤连续灌胃构建小鼠肾性贫血模型，并通过肾功能和血常规检测鉴定肾性贫血模型是否构建成功。肾性贫血小鼠分别以73958.8、24652.9和14791.8IU/kg三个不同剂量（BmrhEPO蛋白的有效剂量）连续口服BmrhEPO蚕蛹粉，以血液网织红细胞数及百分率作为药效指标，结果显示，三组小鼠的血液网织红细胞数及百分率与阴性对照组相比均有明显升高，并且与口服剂量呈正相关，这表明口服BmrhEPO治疗小鼠肾性贫血有效。本研究为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了实验依据。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

第一章 引言

1 EPO的研究进展

1．1 EPO的历史

1．2 EPO的生理学

1．3 EPO的分子生物学和细胞生物学

1．4 EPO的临床应用

1．5 药物研发最新进展

1．6 EPO的表达

2 家蚕杆状病毒表达系统的研究进展

3 多肽和蛋白质药物口服给药研究进展

第二章 实验方案设计

1 实验目的和意义

2 研究内容

3 实验设计路线图

第三章 重组人EPO家蚕杆状病毒的构建及鉴定

1 材料、试剂与仪器

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 主要溶液的配制

2 方法

2．1 pFast Bac Ⅰ-hEPO重组载体的构建

2．2 重组Bacmid-hEPO的构建及鉴定

2．3 家蚕卵巢上皮细胞BmN细胞的复苏、培养与冻存

2．4 重组家蚕杆状病毒vBm-rhEPO的构建

3 结果

3．1 hEPO基因的获得

3．2 重组质粒pFastBac Ⅰ-hEPO的PCR和双酶切鉴定结果

3．3 重组Bacmid-hEPO的PCR鉴定结果

3．4 重组病毒vBm-rhEPO的鉴定

4 讨论

第四章 实时荧光定量PCR测定重组病毒vBm-rhEPD的滴度

1 材料、试剂与仪器

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 实时荧光定量PCR引物的设计

2．2 重组Bacmid-hEPO的提取及含量的测定

2．3 重组病毒vBm-rhEPO基因组的提取

2．4 标准曲线的绘制

2．5 重组病毒vBm-rhEPO滴度的测定

3 结果

3．1 荧光定量PCR标准曲线的绘制

3．2 重组杆状病毒滴度的测定

4 讨论

第五章 rhEPO蛋白在家蚕生物反应器中的表达

1 材料、试剂和仪器

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 试剂配制

2 方法

2．1 rhEPO蛋白在家蚕卵巢上皮细胞BmN细胞中的表达及鉴定

2．2 rhEPO蛋白在五龄蚕幼虫的血淋巴中的表达及鉴定

2．3 rhEPO蛋白在家蚕的蛹中表达及鉴定

2．4 BmrhEPO蚕蛹冻干粉的制备及其中rhEPO含量的检测

3 结果

3．1 rhEPO蛋自在BmN细胞中表达的SDS-PAGE和Western Blotting鉴定

3．2 rhEPO蛋白在五龄蚕幼虫血淋巴中表达的SDS-PAGE和Western Blotting鉴定

3．3 rhEPO蛋白在家蚕的蛹中表达的SDS-PAGE和Western Blotting鉴定

3．4 BmrhEPO蚕蛹冻干粉的制备及其中rhEPO含量的检测

4 讨论

第六章 BmrhEPO蛋白体外生物学活性检测

1 材料、试剂和仪器

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 TF-1细胞的培养

2．2 使用MTT法检测BmrhEPO蛋白的体外生物学活性

3 结果

3．1 使用MTT法检测BmrhEPO蛋白的体外生物学活性

4 讨论

第七章 小鼠口服BmrhEPO蚕蛹粉急性毒性实验

1 材料与动物

2 方法

2．1 口服给药溶液的配制

2．2 小鼠口服BmrhEPO蚕蛹粉急性毒性实验

3 结果

4 讨论

第8章 小鼠口服BmrhEPO蚕蛹粉药效学实验

1 材料与试剂

1．1 材料

1．2 试剂

2 方法

2．1 小鼠肾性贫血模型的构建

2．2 小鼠口服BmrhEPO蚕蛹粉药效学实验

3 结果

3．1 小鼠肾性贫血模型的鉴定

3．2 小鼠口服BmrhEPO蚕蛹粉药效学

4 讨论

结论

参考文献

致谢