结肠癌细胞获得性5-氟脲嘧啶耐药的机制研究

摘要

本研究将采用高浓度的5-FU来处理人结肠癌DLDl和DLD1-TRAIL/R细胞，以建立获得性5-FU耐药的结肠癌细胞，并通过分析耐药细胞的生物学特性，以探讨获得性5-FU耐药的可能机制。 实验方法：在台盼蓝染色后用血细胞计数器计数存活细胞进行细胞活力测定；通过Western免疫印迹检测各种蛋白表达水平；流式细胞仪检测处理后肿瘤细胞的细胞周期的测定；在得到细胞存活率后用CurveExpert软件计算各种化疗药物的IC50；各处理组间的差异采用配对的t检验来评估。 研究结果与讨论：1)、5-FU耐药细胞株的建立及细胞活力测定：用浓度逐渐增高(10μM-400μM)的5-FU反复处理DLD1和DLD1-TRAIL/R细胞后，最终得到了5-FU耐药的细胞，细胞再经不同浓度的5-FU处理4天后，DLD-1细胞的IC50为2.5μM，而DLD1-5-FU/R的则高达210.6μM(后者为前者的84倍)；与此同时DLD1-TRAIL/R的IC50仅为4.4μM，而DLD1-TF/R的却高达105.7μM(后者为前者的24倍)，(P＜0.01)。另外耐药细胞经紫杉醇、顺铂、丝裂霉素以及TRAIL蛋白处理后其IC50与亲代细胞无明显差异(P＞0.05)，说明这些耐药细胞是对5-FU特异性耐药。2)、各种蛋白及Bcl-2家族在5-FU耐受细胞株中的过表达及S期停滞在5-FU耐受细胞的改变：Western免疫印迹结果显示胸苷酸合成酶、Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-w、XIAP、survivin和ILP-2等蛋白在四个细胞株中的表达无明显差别。Mdr蛋白在DLD1-TF/R中的表达比其他细胞略高；而Bik、Bcl-Xs以及Bcl-XL蛋白在耐药细胞DLD1-5-FU/R和DLD1-TF/R中的表达均比各自的亲代细胞明显增高，其中Bcl-XL是唯一抗凋亡的保护性蛋白，这说明Bcl-XL蛋白可能是在5-FU耐药中起了重要的作用。用不同浓度的5-FU处理细胞3天后分析其细胞周期的变化，发现5-FU可以诱导敏感细胞停滞于S期，而对耐药细胞的细胞周期几乎没有影响。接着用200μM浓度的5-FU处理5-FU敏感细胞24小时，磷酸化H2A.X的表达明显增高，而且随着处理时间的延长其表达就越高；然而用相同浓度的5-FU处理5-FU耐药的细胞，未见相同的现象，这说明5-FU的耐药与DNA的损伤相关。3)、过表达的Bcl-XL蛋白在5-FU耐药中的作用：我们通过将pGT60-hBcl-XL质粒转染至DLD1亲代细胞得到稳定高表达Bcl-XL的细胞克隆(DLD-1/Bcl-XL)。接着数据显示5-FU在DLD1/Bcl-XL细胞中的IG50为4.5μM，是亲代DLD1细胞的1.8倍。同样，流式细胞仪检测结果以及Western免疫印迹法对caspase-3的检测结果均提示高表达Bcl-XL对5-FU诱导的凋亡具有一定的保护作用，但是结果同时也显示DLD1/Bcl-XL细胞在5-FU处理后仍然出现S期停滞和磷酸化H2A.X水平的升高。 研究结论： 1)、获得性5-FU耐药的结肠癌细胞中存在Bcl-XL的过度表达，且无5-FU诱导的DNA损伤和细胞周期改变； 2)、过表达Bcl-XL能造成结肠癌细胞在一定程度上抵抗5-FU诱导的细胞凋亡但不影响5-FU诱导的DNA损伤-2-及细胞周期改变； 3)、Bcl-XL的过度表达不是结肠癌获得性5-FU耐药的主要原因，应该存在其他未知的机制。

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

References:

结直肠癌辅助治疗的进展

致谢