传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析

摘要

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)侵染鸡法氏囊组织的B淋巴母细胞，导致严重的免疫抑制。为了探索IBDV感染及其编码基因转化对宿主细胞代谢的影响，本论文以Vero细胞为模型，利用LongSAGE技术(Long serial analysis of gene expression，LongSAGE)，对IBDV感染、A节段、VP2/4/3、VP5基因转染的Vero细胞进行基因表达差异分析，从不同角度挖掘病毒感染过程中，细胞基因表达的调控网络关系，寻找病毒感染与细胞抗病毒过程中重要的基因及其相关通路。 (一)传染性法氏囊病病毒A节段eDNA克隆 以传染性法氏囊病病毒NB株(弱毒株)基因组dsRNA为模板，采用LA-PCR一步法扩增并克隆了IBDV基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，IBDV基因组A节段全长共3,259个核苷酸，包括5’、3’-端的非编码区(NCR)和两个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2)，与GenBank中IBDV其他毒株同源性为81.8-99.9％，与JDl、Cu-1、P2、CEF94等毒株的关系最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。其中ORF1编码1012个氨基酸的多聚蛋白(VP2/4/3)与JD1同源性高达99.5％，VP2片段与JD1、CEF94和D78同源性为99.8％，VP3片段与JD1同源性99.2％，VP4片段与JD1同源性100％，VP5片段与JD1、HZ2、P2、CEF94、CT、Cu-1和D78同源性99.3％。 (二)表达IBDV编码基因的Vero克隆化细胞系构建 将IBDV A节段、VP2/4/3、VP5、VP2、VP3等基因片段分别克隆入真核表达载体pEGFP-C2和pCI-neo，构建了pEGFP-VP5、pEGFP-pVP2系列、pCI-neo-A、pCI-neo-VP2/4/3、pCI-neo-VP5、 pCI-neo-VP3、pCI-neo-pVP2系列等21种真核表达质粒，在Lipofectamine 2000介导下转染Vero细胞，利用荧光显微镜进行蛋白表达分析，结果显示：pEGFP-VP5转染Vero细胞后4-5h，能在细胞膜周围观察到与EGFP融合表达的VP5蛋白；pEGFP-pVP2系列蛋白在转染后9-12h开始出现绿色荧光细胞。在此基础上运用非融合表达的pCI-neo重组真核表达质粒转染Vero细胞，在G418抗性筛选下，进行表达IBDV A、VP2/4/3、VP5、VP2、vP3细胞的克隆，通过PCR/Southern blot、RT-PCR/Northern blot、IFA/IPMA等鉴定，获得了以下克隆化细胞系：获得了2株A节段可稳定表达其编码蛋白VP2、VP4、VP3和VP5蛋白的克隆化细胞系；获得了3株能稳定表达VP2、VP4、VP3的含VP2/4/3基因克隆化Vero细胞；获得了7株能稳定表达IBDV VP5蛋白的克隆化细胞：获得了17株能持续性表达不同VP2截短蛋白的克隆化细胞系；获得了3株稳定表达VP3蛋白的克隆化细胞系。 (三)LongSAGE文库构建及数据分析 应用LongSAGE技术，分别从IBDV感染的Vero细胞、Vero-A+9C4细胞、Vero-VP2/4/3+4G8细胞、Vero-VP5+2F11细胞及正常Vero细胞中抽提mRNA，建立了5个LongSAGE文库。验证转化效率与转化子大小后，各文库随机选取2000个插入片段大于500bp的转化子进行DNA测序分析。共获得代表24475(占总标签数的25.44％)种不同转录本的96213个随机标签，3124种转录本能与在人类染色体上找到相应位置(定位率为12.76％)。其中，从IBDV感染的Vero细胞库中获得代表9187种不同转录本的22193个标签；从正常Vero细胞库中获得代表8369种不同转录本的17663个标签；从Vero-VP5细胞库中获得代表7130种不同转录本的14221个标签；从Vero-A细胞库中获得代表10160种不同转录本的22968个标签；从Vero-VP2/4/3细胞库中获得代表8840种不同转录本的19168个标签。 库间转录本表达差异分析显示：与正常的细胞相比较(P<0.05)，IBDV感染的细胞出现37种转录本表达上调、84种转录本表达下调，Vero-A细胞出现40种转录本表达上调、104种转录本表达下调，Vero-VP2/4/3细胞出现43种转录本表达上调、74种转录本表达下调，Vero-VP5细胞出现36种转录本表达上调、18种转录本表达下调。与IBDV感染细胞相比(P<0.05)，Vero-A细胞(335种转录本)、Vero-VP2/4/3细胞(334种转录本)、Vero-VP5细胞(91种转录本)出现显著水平的表达差异。与Vero-A细胞相比较，Vero-VP2/4/3细胞(49种转录本)、Vero-VP5细胞(113种转录本)出现表达水平的显著差异。与Vero-VP2/4/3细胞相比较，Vero-VP5细胞(104种转录本)均出现表达水平的显著差异。染色体定位结果显示：在23条人类染色体上，共有3124个注释基因获得定位。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分文献综述

第一章传染性法氏囊病病毒研究现状

1 IBDV发现历史

2病毒学分类地位

3基因组结构及编码蛋白功能

4病毒复制及分子机制

5 IBDV致病机理与细胞凋亡

6抗原与毒力变异

7拯救技术在IBDV的研究中的应用

8 小结

第二章基因表达系列分析及相关技术研究进展

1 SAGE技术的原理

2 SAGE文库构建方法的改进

3 SAGE标签的注释

4 SAGE文库之间差异比较

5 SAGE获得的表达差异基因的进一步实验分析

6.SAGE-like技术

7 SAGE及相关技术的应用

8结束语

第二部分研究内容

第一章传染性法氏囊病病毒NB株基因组A节段全长cDNA克隆

1材料和方法

2结果

3讨论

第二章传染性法氏囊病毒感染前后Vero细胞基因表达差异分析

1材料和方法

2结果

3讨论

第三章传染性法氏囊病病毒A节段或VP2/4/3基因转化的Vero细胞基因表达差异分析

1材料和方法

2结果

3讨论

第四章表达传染性法氏囊病毒VP5蛋白的Vero细胞系建立及其转录本分析

1材料与方法

2.结果

3讨论

第五章表达传染性法氏囊病毒pVP2及其截短突变体蛋白的Vero细胞系的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

第六章表达传染性法氏囊病毒VP3蛋白的Vero细胞系的建立

1材料和方法

2结果

3讨论

全文总结

附表

参考文献

第三部分附录

致谢