识别B系白血病细胞新单抗ZCH-2F10的制备、鉴定及其生物学特性和临床预后意义研究

摘要

目的：
　　白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs）是一小群具有自我更新能力以及无限增殖和分化潜能的细胞，其通过不对称分裂维持群体存在。LSCs的存在可以部分解释难治及复发性白血病的治疗抵抗性和复发。急性淋巴细胞性白血病(Acutelymphoblastic leukemia，ALL)是儿童最常见的血液系统恶性肿瘤。作为一种异质性的疾病，急性B淋巴细胞性白血病（B-ALL）代表恶性转化的B淋巴系前体细胞的克隆增殖。尽管有研究支持B-ALL中LSCs的存在，然而对其免疫表型的定义则存在较大争议。最近，有报道CD9分子或许可用于鉴定B-ALL中LSCs;此外，靶向CD9分子及其下游信号通路的治疗或许会是一种新的B-ALL治疗策略。为了进一步探索CD9分子对于B-ALL的生物学以及临床意义，本课题进行了如下三个部分内容的研究:(1) ZCH(Zhejiang Children's Hospital)-2F10单克隆抗体的制备和鉴定;(2)2F10抗体的生物学特性研究;(3) CD19±CD34±2F10±免疫表型细胞比例与B-ALL微小残留病水平的相关性研究。
　　方法：
　　1.2F10单克隆抗体的制备和鉴定
　　1.1 2F10杂交瘤细胞株的建立:以Nalm-6细胞免疫BLAB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备2F10杂交瘤细胞株;通过有限稀释法对2F10杂交瘤细胞进行亚克隆，获得最高纯度的杂交瘤细胞株;通过流式细胞术(Flow cytometry，FCM)鉴定2F10抗体的免疫球蛋白亚类。
　　1.2 2F10抗体重、轻链可变区基因的序列分析:根据鼠免疫球蛋白重、轻链可变区的恒定区和框架区设计引物;通过RT-PCR扩增2F10抗体重、轻链可变区基因序列VH2F10和VL2F10。采用DNA全自动测序仪测定VH2F10和VL2F10基因序列。
　　1.3 2F10-FITC直标抗体的制备:采用SPA Sepharose亲和层析法从腹水中纯化2F10抗体;聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度及分子量;采用改良Marshall法制备2F10-FITC直标抗体，并通过FCM鉴定。
　　1.4 2F10抗体识别抗原的蛋白鉴定:Western blot法鉴定2F10抗原蛋白的分子量;将Nalm-6细胞蛋白裂解液经免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）法纯化后行SDS-PAGE检测，胶上的抗原蛋白条带送串联质谱分析。此外，通过阻滞实验进一步验证2F10抗体识别的抗原。
　　1.5 2F10抗体识别抗原表达谱的研究:FCM比较2F10抗原和美国Becton-Dickinson(BD)公司的CD9抗体（克隆名:M-L13）识别的抗原在白血病细胞株、正常人外周血细胞以及儿童急性白血病幼稚细胞上的表达。
　　2.2F10抗体的生物学特性研究
　　2.1 2F10抗原抗体系统的生物学特性研究:通过木瓜酶消化结合FCM检测抗体内化程度;通过补体依赖的细胞毒实验(CDC)了解2F10抗体与抗原特异性结合及激活补体的能力;以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记细胞增殖，通过FCM检测Nalm-6细胞表面2F10抗原和CD19抗原在不同增殖状态时的表达。
　　2.2 2F10抗体的白血病动物模型体内治疗作用研究:连续2天腹腔注射环磷酰胺，24h后尾静脉注射Nalm-6细胞5×106个/只裸鼠，建立急性B淋巴细胞性白血病动物模型。分别在一周和两周后，从尾静脉注射2F10抗体，密切观察小鼠状况，比较小鼠生存时间的差异。
　　3.CD19±CD34±2F10±免疫表型细胞比例B-ALL微小残留病水平的相关性研究:于初诊时，通过FCM分析并确定免疫表型为CD34+CD38-、CD19±CD34±2F10±和CD19±CD34±CD9±的细胞比例。在治疗第22天时，进行微小残留病检测。应用Spearman秩相关系数分析初诊时相应免疫表型细胞比例与治疗第22天的微小残留病水平之间的联系。
　　结果：
　　1.2F10单克隆抗体的制备和鉴定
　　1.1 2F10杂交瘤细胞株的建立:应用细胞融合技术并通过流式细胞术(FCM)筛选到阳性克隆株2F10。亚克隆获得高纯度的细胞系C7。FCM检测免疫球蛋白亚型显示，2F10抗体和羊抗鼠IgG1抗体的反应阳性率为99.38％，和羊抗鼠轻链κ抗体的反应阳性率为99.61％，表明2F10抗体的免疫球蛋白亚型为鼠IgG1κ。
　　1.2 2F10抗体重、轻链可变区基因的序列分析:VH2F10基因全长360bps，VL2F10基因全长348bps，分别编码120和116个氨基酸残基。互联网在线分析显示，VH2F10含有4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR); VL2F10含有4个FR和3个CDR。
　　1.3 2F10-FITC直标抗体的制备:经SDS-PAGE鉴定，2F10抗体的重链和轻链分子量分别约为54kDa和25kDa。以改良Marshall法成功制备直标抗体2F10-FITC。滴定结果显示0.3μg2F10-FITC直标抗体即可以饱和1×106个Nalm-6细胞。
　　1.4 2F10抗体识别抗原的蛋白鉴定:Western blot鉴定证实2F10抗原的分子量为24kDa左右。串联质谱分析提示2F10抗体识别的抗原可能是CD9。2F10抗体对CD9-FITC的阻滞实验显示，2F10抗体能完全阻滞CD9-FITC与靶细胞的结合，CD9-FITC于阻滞前后的阳性率分别为90.34％和0.83％。
　　1.5 2F10抗体识别抗原表达谱的研究:2F10抗原和CD9抗原均在Nalm-6细胞与MEG-1细胞上高表达，在正常人外周血红细胞上不表达，在B、T淋巴细胞表面弱表达，而在中性粒细胞、单核细胞及血小板上表达较强。同时，2F10抗原还在HL-60细胞上呈现相对高表达。在NK细胞中，2F10+细胞亚群比例显著高于CD9+细胞亚群。此外，2F10抗原和CD9抗原在儿童急性白血病幼稚细胞上均呈现不均一性表达。
　　2.2F10抗体的生物学特性研究
　　2.1 2F10抗原抗体系统的生物学特性研究:通过木瓜酶消化结合FCM检测发现，2F10抗体在4℃和37℃均可以快速“内化”（2F10-FITC与Nalm-6细胞于4℃和37℃孵育5min后再行木瓜酶酶切，流式检测阳性反应率分别达到99.01％和99.17％)。2F10抗体能激活补体，介导CDC作用杀伤Nalm-6细胞（按0.1μg抗体:10μl补体:5×104个细胞的比例，Nalm-6细胞死亡率为78.88±5.23％）。通过流式细胞仪同时检测BrdU和细胞表面抗原发现，随着Nalm-6细胞进入S期，免疫表型为CD19+2F10+的细胞群体比例增加。而当Nalm-6细胞处于低增殖状态（或静息期）时，则免疫表型为CD19+2F10-、CD19-2F10-和CD19-2F10+的细胞群体比例增加。
　　2.2 2F10抗体的白血病动物模型体内治疗作用研究:利用Nalm-6细胞移植裸鼠成功建立了急性B淋巴细胞性白血病动物模型。此外，小鼠尾静脉注射5×106个Nalm-6细胞后平均(47.2±4.8)天后肢行动迟缓，迅速发展为后肢瘫痪。随着病情进展，小鼠严重消瘦，并伴有脊柱侧弯，弓背，呈恶病质，直至最后死亡。在晚期干预组中，其生存时间（中位生存时间为63.5天）接近于对照组（56天）。然而，在早期治疗组中，截止2013年3月31日，小鼠已存活93天，目前仍存活良好。
　　3.CD19±CD34±2F10±免疫表型细胞比例与B-ALL微小残留病水平的相关性研究:初诊时CD34+CD38-细胞比例与B-ALL第22天微小残留病水平不相关（P=0.4759，Spearman秩相关系数r=0.0848）。然而，CD19-CD34+2F10-细胞和CD19-CD34+CD9-细胞比例与第22天微小残留病水平相关(P=0.0128，r=0.4566;P=0.0499,r=0.4440)。
　　结论：
　　1.成功制备了可识别急性B淋巴细胞性白血病细胞的单克隆抗体ZCH-2F10，其属于鼠IgG1κ免疫球蛋白亚型。2F10单抗能够识别CD9抗原。2F10抗体的重、轻链分子量分别约为54kDa和25kDa。2F10抗体重链可变区基因全长360bps，轻链可变区基因全长348bps。
　　2.成功制备了具有良好敏感性和特异性的2F10-FITC荧光抗体。2F10抗原在儿童急性白血病细胞上的表达呈异质性。
　　3.2F10抗体和抗原结合后能够快速内化至细胞内。2F10抗体能激活补体，发挥明显的CDC作用从而靶向杀伤Nalm-6细胞。与处于高增殖状态的Nalm-6细胞相比，处于低增殖状态的Nalm-6细胞具有更高比例的CD19+2F10-、CD19-2F10-和CD19-2F10+细胞亚群。
　　4.成功建立了急性B淋巴细胞性白血病动物模型。2F10单抗对早期B-ALL动物模型具有良好的治疗效果。
　　5.初诊时CD19-CD34+2F10-细胞和CD19-CD34+CD9-细胞比例均与B-ALL的第22天微小残留病水平相关。