大鼠骨髓间充质干细胞表面蛋白质组学研究

摘要

间充质干细胞（Mesenchymal stromal cells，MSCs）是一类分布广泛的成体干细胞，具有易于分离和可长期传代培养的特性，在体外MSCs可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、肝细胞和神经样细胞等多种类型的细胞，因此MSCs在再生医学和细胞治疗中有广泛应用。
　　将不同组织来源的MSCs移植到同种或不同物种的各种病变模型中都得到了积极的效果，但疗效存在差异。不同来源的MSCs的分化能力及分化决定簇并不相同。迄今，还没有一种确定的细胞表面标志用于MSCs的鉴定，难以进行MSCs的质量控制，限制了MSCs的研究与应用。MSCs的复杂性需要从蛋白质组学水平来对其分子特性与生物学功能之间的关系以及其谱系来源与分化规律进行阐述。
　　在本研究中，我们以4-7代的大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrowmesenchymal stromal cells，rBMMSCs）为材料，采用生物素共价结合细胞膜蛋白、链霉亲和素纯化的方法得到了rBMMSCs膜蛋白样品。纯化蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后进行切胶、胶内酶解，然后对酶解片段进行质谱分析，一共鉴定出2637种蛋白。根据Swissprot注释，跨膜蛋白、脂锚定蛋白和分泌蛋白共有674种，我们随机从这674种膜蛋白中挑选了65种进行RT-PCR验证，结果有63种有表达，证明了极低的错误鉴定率，其中部分鉴定出的膜蛋白还用WB和ICC法进行了蛋白水平的验证。我们用DAVID在线软件对这674种膜蛋白进行了分析，根据Molecule Function注释，rBMMSCs表达许多转运和离子通道相关蛋白;对rBMMSCs信号转导分子表达情况分析显示，与小鼠胚胎干细胞不同，rBMMSCs富集了较多的神经谱系的蛋白，为rBMMSCs膜蛋白神经偏向性提供了线索;根据Uniprot注释对组织特异性分类显示，在rBMMSCs膜蛋白的13种组织特异性分布中有10种是神经、神经内分泌谱系或者可以归结为神经嵴发育起源，这为rBMMSCs膜蛋白神经偏向性提供了又一线索;我们将rBMMSCs膜蛋白数据与人和小鼠的胚胎干细胞及人的MSCs数据进行了比较，进一步证实了rBMMSCs膜蛋白的神经、神经内分泌谱系偏向，rBMMSCs与人的MSCs膜蛋白组学表达之间的差异还表明不同物种来源的MSCs具有不同的谱系偏向及分化潜能;最后我们对rBMMSCs与人的MSCs的神经分化潜能进行了验证，发现rBMMSCs对于神经诱导更加敏感，这可能是rBMMSCs具有更强的神经分化能力的体现。
　　本研究中我们得到了最全面的rBMMSCs膜蛋白信息，揭示了rBMMSCs膜蛋白谱系表达特性，为不同组织和物种来源的MSCs分化能力的差异提供了蛋白组学方面的数据支持，为MSCs的鉴别提供了线索。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 引言

2 间充质干细胞的特性

2．1 间充质干细胞特异性的表面抗原研究

2．2 间充质干细胞的发育起源

2．3 间充质干细胞的免疫抑制作用

3 蛋白组学的应用

4 膜蛋白的收集方法

4．1 根据膜蛋白的分子特性进行分离

4．2 细胞表面捕获技术

5 质谱法鉴定膜蛋白

5．1 破碎原理

5．2 质谱信息的解读

5．3 串联质谱的数据解析方法

6 展望

参考文献

第二章 大鼠骨髓间充质干细胞的获取与膜蛋白纯化

1 引言

2 材料方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 原代细胞的分离培养

3．2 细胞特性鉴定

3．3 生物素共价结合效率鉴定

3．4 LC-MS／MS鉴定

4 本章小结

参考文献

第三章 rBMYSCs膜蛋白组学分析验证及神经偏向性表达

1 引言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 rBMMSCs膜蛋白的功能特性

3．2 rBMMSCs膜蛋白信号转导分子

3．3 rBMMSCs信号转导分子表达验证

3．4 rBMMSCs膜蛋白组织特异性分布

3．5 神经偏向性组织特异性分布验证

3．6 神经分化潜能

4 本章小结

5 讨论

5．1 相对局限的和神经偏向的信号分子表达特性

5．2 神经偏向性的组织特异性表面分子的表达

5．3 对于神经诱导的化学试剂更加敏感

参考文献

附录

作者简历