拟胚体诱导心肌分化及其机理研究

摘要

拟胚体(Embryoid bodies，EBs)是一种在形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的一种球状结构。它是研究早期胚胎发育过程中各个阶段基因的时空表达和调控的理想材料。胚胎干细胞在添加分化抑制物滋养层细胞或LIF等条件下，可以在体外无限增殖并一直保持其未分化的状态，当移除以上抑制物后胚胎干细胞将会逐渐分化。如果这时在体外对胚胎干细胞或者iPS细胞进行悬浮培养，其会逐渐形成三维球状结构即拟胚体。拟胚体能够在体外分化出类似体内的三胚层结构。而心脏又是脊椎动物早期胚胎发育中可以被率先检测到的组织之一，因此利用拟胚体法研究心肌分化也是非常有效的方法。悬滴法是经典的制备拟胚体的方法，但是因为其操作流程相对繁琐，而且产生的拟胚体在形态上不均一，异质性比较严重，这就影响了分化过程中的同步性。尽管如此，现如今主要的制备拟胚体的方法还是由悬滴法衍变而来，如通过离心处理来促使胚胎干细胞形成拟胚体，此方法已经被很多学者所采用。本实验所探索出的系统与传统的悬滴法所形成的拟胚体相比无论是在形态均一性还是分化成功率上都有明显提高，并且操作流程简便。该系统非常适合于机械化操作的自动化系统，其同样适合于以干细胞为材料的大规模药物筛选系统。
　　本实验中，我们通过小鼠胚胎成纤维细胞成功诱导产生iPS细胞，经过多层次的鉴定:RT-PCR，定量PCR，AP染色，免疫细胞化学，拟胚体分化，畸胎瘤，证明了其具备iPS细胞的全部特征。之后我们以小鼠iPS细胞及D3小鼠胚胎干细胞为原始材料，借助本实验室发现的一种PCR Microplate培养板来制备拟胚体，虽然静止法及离心法都能制备出拟胚体，但离心法制备出的拟胚体形态均一，同质性比较好，又因其凹槽深也去除了Aggrewells培养板的弊端。在拟胚体的制备过程中，也没有发现其与D3细胞形成的拟胚体存在太大的差异。在借助PCR Microplate培养板来制备拟胚体的过程中，我们也对影响拟胚体形成质量的几种因素做了相应的探索，如初始密度，离心力。并在之后的试验中逐步优化制备流程，最终产生状态理想的拟胚体。然后我们以心肌搏动为指标进行了统计分析。发现经过离心处理的拟胚体心肌搏动比例明显高于静止状态下的。除对产生的拟胚体在形态上进行了研究之外，我们还对拟胚体的标志性基因及干性基因的时空表达情况通过定量PCR的方法进行了检测分析。结果也证明我们所制备的拟胚体状态良好。最后我们对影响拟胚体心肌分化的经典Wnt/β-catenin信号通路采用定量PCR及Western blot的试验方法进行了相关的研究，首次发现离心力在拟胚体诱导心肌分化的早期对Wnt/β-catenin信号通路有一定影响，从而提高了拟胚体心肌分化的比例。
　　本实验探索的高效制备拟胚体的新方法，不仅有着同步性好与可重复性强的突出优点，同时也为研究者研究心肌分化过程中各类基因的调节机理提供了原始材料。此外，因为iPS细胞在心脏疾病方面的潜在应用价值，本实验对小鼠拟胚体制备体系的优化，可以为iPS细胞借助拟胚体诱导心肌分化的方法提供更多的借鉴，这也间接地为人类心脏疾病的治疗做了铺垫。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 拟胚体诱导心肌分化的研究进展

1 胚胎干细胞的产生

2 iPS细胞的产生

2．1 iPS的诱导

2．2 iPS的应用

2．3 iPS面临的问题及前景

3 心肌分化的进展

3．1 心肌分化的研究方法

3．2 拟胚体的制备

3．3 影响拟胚体心肌分化的因素

4 小结

参考文献

第二章 小鼠胚胎成纤维细胞诱导产生iPS细胞

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 方法

3 结果

3．1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养

3．2 幔病毒向胚胎成纤维细胞中转入iPS诱导因子

3．3 定量PCR进行标志基因的检测

3．4 iPS细胞的碱性磷酸酯酶染色

3．5 iPS细胞特异性标志的免疫细胞化学鉴定

3．6 iPS细胞经拟胚体分化成三胚层实验

3．7 iPS细胞的小鼠体内畸胎瘤实验

4 讨论

参考文献

第三章 拟胚体法诱导心肌分化及其机理研究

1 引言

2 材料方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 方法

3 结果

3．1 小鼠胚胎成纤维细胞与iPS细胞的培养

3．2 iPS细胞与D3形成拟胚体形态差异

3．3 离心力对拟胚体形态的影响

3．4 不同密度对拟胚体心肌分化的影响

3．5 不同离心力对拟胚体心肌分化的影响

3．6 定量PCR法检测心肌细胞特异性基因及干性基因的表达情况

3．7 定量PCR法检测离心力对Wnt基因家族各基因的影响

3．8 定量PCR法检测离心力对β-Catenin信号通路的影响

3．9 Western Blotting的方法检测离心力对β-Catenin的影响

4 讨论

参考文献

附录

作者简历