Hippo通路效应蛋白YAP调控基因转录的机制与功能研究

摘要

Hippo信号通路是近年来新发现的一条在进化上具有保守功能的细胞信号转导通路。它在调控器官大小、组织稳态、肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。分子机制研究发现，该通路接受多种上游信号，如G蛋白偶联受体信号，机械压力，细胞骨架信号等，通过其核心激酶链作用于下游效应蛋白YAP/TAZ，进而调控基因转录，发挥各种生物学功能。因此，YAP/TAZ如何通过调控基因转录介导Hippo信号通路功能是Hippo信号转导及器官发育和癌症研究的重要课题。YAP/TAZ作为转录辅激活因子，不能直接结合DNA，需要借助于靶转录因子调控靶基因表达。本实验室的前期研究发现了YAP的关键靶转录因子TEAD家族在Hippo通路对基因表达调控中发挥关键作用。然而，我们也发现一部分YAP靶基因的表达依赖于YAP上的一种介导蛋白质相互作用的WW结构域。这提示一些与WW结构域相结合的转录因子可能参与了Hippo信号通路的功能。生物化学研究发现了一些含有PPXY基序的转录因子，如Smads，TBX5，Runx2，p73，ErbB4等能够与YAP/TAZ的WW结构域结合。然而，这些转录因子是否介导YAP/TAZ的依赖于WW结构域的靶基因表达还不清楚，它们在Hippo通路调控器官大小和癌症中的功能也不明确。本项研究从一个同时依赖于TEAD和YAP的WW结构域的YAP靶基因整合素ITGB2的表达调控入手，通过转录因子文库筛选和亲和纯化两种系统性手段发现了YAP结合的新转录因子组蛋白甲基化转移酶家族成员PRDM4。进一步分析发现TEAD和PRDM4分别结合在ITGB2启动子的不同位点，并通过与YAP相互作用协同激活ITGB2的表达。功能研究发现ITGB2的诱导表达可能在YAP/TAZ调控细胞粘着和迁移中发挥作用。而PRDM4还可能通过其它靶基因在YAP诱导的细胞癌症转化与肿瘤形成中发挥功能。此外，本项研究还发现了Hippo通路存在一个依赖于转录活性的负反馈调节机制。我们意外地发现在培养的细胞中表达激活型的YAP突变体强烈诱导内源YAP的磷酸化和失活。这提示YAP可以启动一个负反馈机制从而限制自身活性。机制研究发现YAP通过TEAD家族转录因子直接激活上游抑制性激酶Lats2的表达和活性。我们进一步发现，这一反馈机制不仅在细胞响应Hippo信号通路上游信号如血清和细胞失去接触抑制时被激活，也在小鼠肝脏内YAP诱导肿瘤发生的过程中被激活。因此该机制可能在机体应对体内复杂环境，保持器官大小稳态，抑制肿瘤发生上发挥重要作用。总之，通过研究Hippo信号通路效应分子YAP调控基因转录的机制和功能我们发现了Hippo信号通路新的靶转录因子和靶基因，发现了Hippo通路调控细胞粘着、迁移、转化、肿瘤形成以及自身稳态的转录水平分子机制。

目录

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致谢

摘要

缩略词清单

第1章 引言

1．1 Hippo通路的组成

1．1．1 果蝇中Hippo通路的组成

1．1．2 哺乳动物Hippo通路的组成

1．2 Hippo通路的生物学功能

1．2．1 Hippo通路调控器官大小

1．2．2 Hippo通路调控调控干细胞自我更新与组织再生

1．2．3 Hippo通路调控癌症发生

1．3 YAP是一个转录辅激活因子

1．3．1 YAP结合转录因子TEAD

1．3．2 YAP的WW结构域参与转录调控

1．3．3 YAP调控的靶基因

1．4 YAP的调控机制

1．4．1 磷酸化修饰对YAP的调控

1．4．2 蛋白质相互作用对YAP的调控

1．4．3 VGLL4对YAP的抑制

1．5 PRDM4与甲基化转移酶家族

1．5．1 SET结构域与组蛋白甲基化转移酶

1．5．2 PRDM家族蛋白分类与甲基化酶活性

1．5．3 PRDM4的分子基础与生物学功能

1．6 β2整合素

1．6．1 整合素的结构

1．6．2 整合素的调节

1．6．3 整合素参与的inside-out信号通路与outside-in信号通路

1．6．4 β2整合素的分类、表达、配体与功能

1．7 本研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞

2．1．2 小鼠

2．1．3 质粒

2．1．4 抗体

2．1．5 siRNA，shRNA与gRNA靶序列

2．1．6 CHIP引物序列

2．1．7 主要仪器

2．1．8 主要试剂

2．1．9 主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 质粒构建

2．2．2 细胞培养

2．2．3 细胞转染，感染与稳定细胞系的构建

2．2．4 RNA的提取、逆转录与实时荧光定量PCR

2．2．5 免疫印迹

2．2．6 免疫共沉淀

2．2．7 体外激酶活性实验

2．2．8 染色质免疫共沉淀实验(CHIP)

2．2．9 荧光素酶报告基因实验

2．2．10 flow chamber细胞粘着实验

2．2．11 Transwell细胞迁移实验

2．2．12 细胞活力实验

2．2．13 软琼脂克隆形成实验

2．2．14 流体动力注射小鼠模型(HDI)

2．2．15 裸鼠荷瘤实验

第3章 YAP通过PRDM4调控整合素ITGB2表达的机制与功能研究

3．1 ITGB2是YAP的靶基因

3．2 YAP通过结合TEAD和另一个含PPXY基序的转录因子激活ITGB2

3．3 PRDM4是YAP结合的含PPXY基序的转录因子

3．4 PRDM4诱导ITGB2的表达

3．5 TEAD与PRDM4在ITGB2启动子上的结合的位点分析

3．6 PRDM4与ITGB2在YAP诱导的细胞粘着与迁移中的作用

3．7 PRDM4与ITGB2在YAP诱导的肿瘤形成中的作用

3．8 PRDM4结合YAP调控的其它靶基因与功能

3．9 本章小结与讨论

第4章 YAP通过诱导Lats2表达形成Hippo通路活性负反馈机制

4．1 激活型YAP诱导Lats2的表达和活性

4．2 激活型YAP对Lats2的调控依赖于TEAD

4．3 YAP-TEAD直接结合到Lats2的启动子

4．4 Hippo通路生理刺激激活YAP诱导的负反馈机制

4．5 YAP激活诱导的肿瘤发生过程激活负反馈机制

4．6 本章小结与讨论

参考文献

作者简历及科研成果