人醇脱氢酶（ADH）相关等位基因的克隆与序列分析

摘要

目的：克隆人Ⅰ型醇脱氢酶(ADH)等位基因的编码区序列，为构建Ⅰ型ADH单个等位基因的真核表达系统做准备。利用生物信息学技术区分Ⅰ型ADH基因的不同等位基因并分析其单核苷酸多态性。 方法：根据从GenBank数据库中检索到的ADH1B基因cDNA的RefSeq序列，用PRIMER5软件在编码区两侧设计一对引物，其中上游引物中有一起始密码子并在5'端加上一个XbaⅠ限制性酶切位点，下游引物中有一终止密码子并在5'端加上一个EcoRⅠ限制性酶切位点，使扩增产物包含完整编码区序列。取人癌旁正常肝组织，用TRIzol试剂盒提取总RNA后，利用两步法RT-PCR先获得Ⅰ型ADH等位基因的cDNA，然后PCR扩增出大量的Ⅰ型ADH等位基因编码区序列。再用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经过蓝白筛选后，用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析进行鉴定，另外还用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库分析克隆到的Ⅰ型ADH等位基因的单核苷酸多态性。 结果：①用RT-PCR方法扩增出与预期大小相符的ADH基因片段；②经蓝白筛选获得了带pUC19-ADH重组质粒的白色菌落；③用限制性酶谱分析表明所克隆片段与预期的ADH基因编码区大小相符；④DNA测序后的克隆序列编码区与GenBank数据库中Ⅰ型ADH三个基因cDNA的RefSeq序列编码区用BLAST进行两序列比对分析，结果表明送测的几个重组质粒中，成功克隆了Ⅰ型ADH基因中的ADH1C*1，ADH1C*2和ADH1B*2三个等位基因；⑤用BLAST两序列比对分析表明，ADH1C*1等位基因与ADH1CcDNA的RefSeq序列有2个碱基不一致，而其编码的氨基酸序列完全一致，并且克隆序列所编码氨基酸序列的第272位是精氨酸，第350位是异亮氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为ADH1C*1等位基因。用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库，确定两个不一致的碱基都是同义单核苷酸多态性。⑥用BLAST两序列比对分析表明，ADH1C*2等位基因与ADH1CcDNA的RefSeq序列有6个碱基不一致，而其编码的氨基酸序列有3个氨基酸不一致，并且克隆序列所编码氨基酸序列的第272位是谷氨酰胺，第350位是缬氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为ADH1C*2等位基因。用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库，确定有3个不一致的碱基是同义单核苷酸多态性，而另外3个不一致的碱基是非同义单核苷酸多态性，特别是第272位密码子的第二位碱基和第350位密码子的第一位碱基的这种非同义单核苷酸多态性是区分ADH1C*1和ADH1C*2两个等位基因的依据；⑦用BLAST两序列比对分析表明，ADH1B*2等位基因与ADH1BcDNA的RefSeq序列有2个碱基不一致，而其编码的氨基酸序列有1个氨基酸不一致，并且克隆序列所编码氨基酸序列的第48位是组氨酸，第370位是精氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为ADH1B*2等位基因。用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库，确定其中1个不一致的碱基是同义单核苷酸多态性。而另一碱基的不一致目前并未查到其属于单核苷酸多态性。这种碱基变化使克隆的ADH1B*2等位基因第23位密码子代表的是脯氨酸，而RefSeq相应位置代表的是丝氨酸。推测其可能是PCR反应产生的突变，也可能是一种新的非同义单核苷酸多态性，这需要通过进一步的实验证实。 结论：本研究用常规的基因克隆技术和新的生物信息学方法，证实所克隆片段为ADH1C*1，ADH1C*2和ADH1B*2三个等位基因完整的编码区序列，并构建了pUC19-ADH1C*1，pUC19-ADH1C*2和pUC19-ADH1B*2三个重组质粒。由于克隆序列两端分别加上了一个XbaⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位点，可以定向克隆到适当的真核细胞表达载体中，进一步探循其分子作用机制。序列分析证实ADH1C和ADH1B两个基因的核苷酸序列和氨基酸序列都很相似，特别是编码区两侧碱基序列完全一致，因此用一对引物克隆了两个基因的等位基因。另外，通过SNP分析证实ADH1C和ADH1B两个基因的部分碱基位点存在着单核苷酸多态性。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

英汉缩略名词对照表

致谢

醇脱氢酶(ADH)基因及其多态性与疾病关系研究综述

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