帕立骨化醇在糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化的作用研究

摘要

目的:
　　流行病学显示，我国糖尿病肾病（DKD)已迅速上升为终末期肾病的重要原因，在透析患者中比例仅次于慢性肾小球肾炎。肾小管在 DKD初期便发生改变，伴随着间质纤维化的出现，明显增加肾脏的不良预后。既往研究发现，肾小管-间充质转化（EMT)和肾小管间质纤维化密切相关，且受多种内在机制共同调控，包括 Klotho、Wnt/β-catenin及TGF-β信号途径。因此，通过调控以上目标蛋白的表达或信号途径的传导或可成为抑制 DKD肾小管上皮 EMT及肾间质纤维化的重要途径。
　　本研究利用帕立骨化醇干预 DKD大鼠模型，以探讨其对肾小管上皮 EMT及小管间质纤维化的作用及可能机制，最终为 DKD肾脏纤维化的防治提供新线索。
　　方法:
　　利用链脲佐菌素建立大鼠糖尿病肾病模型。将 DKD大鼠按随机数字表法分为：(1)帕立骨化醇干预组（P组)：帕立骨化醇溶于丙二醇中，于造模成功后第2 d给药，剂量为0.4μg.kg-1，3次/周；(2)糖尿病肾病组（D组)：给予等体积的丙二醇腹腔注射。设置正常对照组(C组)：干预方法同 D组。帕立骨化醇连续干预4周或12周后，取各组大鼠血、尿及肾组织标本。检测一般生化指标；取肾组织进行病理学检查；利用免疫组化及 Western印迹技术检测肾组织 E-钙粘蛋白（E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白（FN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、β-catenin、Wnt-4及 Klotho蛋白的表达；并进行各观察指标间的相关性分析。
　　结果:
　　(1)一般指标：D组大鼠 SCr、BUN、24 h尿蛋白及 U A C R水平均较 C组上升，而P组均较 D组下降(均P<0.05)；与 C组比较，D组血磷与 iPTH水平均上升，血钙下降，但相较于D组，P组血磷与 iPTH均回降，血钙回升(均P<0.05)。
　　(2)病理学检查：C组大鼠肾小管结构完整清晰，无明显病理改变；D组可见肾小管间质局部炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞脱落，小管扩张，基底膜断裂，与C组比较，纤维化面积增大（P<0.05)，而 P组较 D组病理改变较轻，纤维化面积较小（P<0.05)。
　　(3)各组肾组织 E-cadherin、α-SMA及 FN蛋白的表达：D组大鼠肾组织 E-cadherin蛋白表达低于C组，而 P组高于D组(均P<0.05)；与C组比较，D组大鼠肾组织α-SMA与 FN蛋白表达均明显增加，而 P组表达均较 D组减少(均P<0.05)。
　　(4)各组肾组织 TGF-β1、Wnt4、β-catenin及 Klotho蛋白的表达：与 C组比较，D组Klotho蛋白水平降低，而P组较 D组水平升高(均 P<0.05)；与 C组比较，D组TGF-β1、Wnt-4和β-catenin蛋白表达水平显著上升，而与 D组比较，P组以上蛋白的水平均较 D组下降(均 P<0.05)。
　　(5)各观察指标间相关性分析：Klotho蛋白水平和E-cadherin蛋白水平呈正性相关（r=0.924，P<0.05)，而与纤维化面积、α-SMA、FN、TGF-β1、Wnt-4及β-catenin均呈负相关（r=-0.886，P<0.05;r=-0.806，P<0.05;r=-0.623，P<0.05;r=-0.749，P<0.05;r=-0.855，P<0.05;r=-0.881，P<0.05)。
　　结论:
　　(1)帕立骨化醇可抑制 DKD肾小管间质纤维化，改善肾功能，同时减轻尿蛋白，对肾脏具有一定的保护作用。
　　(2)帕立骨化醇可阻断 DKD肾小管上皮的EMT。
　　(3)帕立骨化醇可促进DKD肾小管 Klotho表达，同时抑制肾小管间质 TGF-β1、Wnt-4及β-catenin表达。其中，通过增加 Klotho的表达，从而抑制 Wnt/β-catenin传导途径激活和TGF-β1合成，成为帕立骨化醇阻断 DKD肾小管上皮 EMT及小管间质纤维化的内在途径之一。

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引言

第一章 材料与方法

1 材 料

2 方 法

第二章 结 果

1 糖尿病肾病模型建立情况

2 一般情况

3 体重、肾重与肾重/体重指数

4 空腹血糖

5 血清肌酐与血尿素氮

6 尿蛋白

7 血钙磷与iPTH

8 肾脏病理

9 各组肾组织E-cadherin、α-SMA及FN蛋白的表达

10 各组肾组织TGF-β1蛋白的表达

11 各组肾组织Wnt4及β-catenin蛋白的表达

12 各组肾组织Klotho蛋白的表达

13 各观察指标间的相关性分析

第三章 讨 论

1 帕立骨化醇对糖尿病肾病肾小管上皮间充质转化及TGF-β1表达的影响

2 帕立骨化醇对糖尿病肾病Wnt/β-catenin信号途径的影响

3 帕立骨化醇对糖尿病肾病肾小管上皮Klotho蛋白表达的影响

第四章 主要结论与展望

参考文献

附录A 英文缩写索引

附录B 综述:肾小管上皮间充质转化与肾脏纤维化

在 学 研 究 成 果

致谢