前额皮层-杏仁核-伏隔核环路在海洛因奖赏动机转换中的作用和调控机制

摘要

目的：
　　前额皮层（PFc）、杏仁核到伏隔核（NAc）的谷氨酸能投射对 NAc多巴胺（DA）的释放具有调节作用，但这些环路是否参与海洛因成瘾时奖赏和动机的改变还不清楚。本课题观察激活腹内侧前额皮层（vmPFc）或基底外侧杏仁核（BLA）到伏隔核壳部（NAc shell）通路的代谢型谷氨酸受体2/3（mGluR2/3）及谷氨酸释放对海洛因成瘾大鼠奖赏和动机的影响，从而为海洛因成瘾的早期干预提供理论依据。
　　方法：
　　实验一：首先，大鼠在不同海洛因给药剂量（0.0125,0.025,0.05,0.1 mg/injection/kg）下进行连续14 d的自身给药训练；第15天，大鼠腹腔注射mGluR2/3的激动剂LY379268（0,0.1,0.3,1 mg/kg），随后固定比率1（FR1）程序下进行海洛因自身给药测试，观察 LY379268浓度和海洛因剂量对奖赏的交互作用。其次，另有4组大鼠在固定的海洛因给药剂量下进行连续14 d的训练（0.05 mg/injection/kg,下同）；第15天，大鼠腹腔注射 LY379268（0,0.1,0.3,1 mg/kg），随后累计比率（PR）程序下观察 LY379268对海洛因给药动机的影响。最后，再有4组大鼠进行连续14 d的训练；第15 d，大鼠腹腔注射生理盐水、LY379268（1 mg/kg）、LY341495（1 mg/kg，mGluR2/3的拮抗剂）或LY379268+LY341495，FR1程序下观察LY379268和LY341495对海洛因奖赏的相互影响。
　　实验二：首先，大鼠进行连续14 d的自身给药训练；第15天，大鼠分别在大脑核团腹侧被盖区（VTA）、伏隔核核部（NAc core）或 NAc shell双侧微注射不同浓度的LY379268（0,0.3,1 mg/ml），每侧0.5μl，随后FR1程序下进行自身给药测试，观察 LY379268干预海洛因奖赏的中枢位点。其次，另3组大鼠进行连续14 d训练；第15天，对照组在单侧 vmPFc和对侧 NAc shell给予生理盐水，其它两组在单侧 vmPFc或背内侧前额皮层（dmPFc）注射 GABAA+GABAB激动剂的混合液Muscimol+Baclofen（0.06+0.6 nmol/μl,），在对侧NAc shell均注射LY379268（1 mg/ml），每侧0.5μl，FR1程序下进行自身给药测试。最后，两组大鼠进行连续14 d的训练；第15天，对照组在单侧 BLA和对侧 NAc shell给予生理盐水， BLA-NAc shell组在单侧 BLA注射 Muscimol+Baclofen和对侧 NAc shell注射LY379268，每侧0.5μl， FR1程序下进行自身给药测试。
　　实验三：首先，大鼠在单侧 vmPFc注射谷氨酸能光遗传病毒或阴性对照（NC）病毒，术后进行连续14 d的自身给药训练。第15天，大鼠在 FR1程序下测试vmPFc谷氨酸能神经元激活对奖赏的影响。NC组和vmPFc激活组测试时均用波长470 nm、直流电频率和功率5 mW的蓝光刺激，每次持续1 h，间隔1 h。其次，大鼠在单侧 BLA注射上述病毒并在同侧 NAc shell埋置16通道电极。第15天，大鼠在 FR1程序下测试 BLA谷氨酸能神经元激活对奖赏的影响或在 PR程序下测试对动机的影响。NC组和 BLA激活组测试时均用波长470 nm、频率25 HZ和功率5 mW的蓝光刺激，每次持续1 h，间隔1 h，同时在NAc shell神经元末梢记录刺激前后放电的变化。
　　实验四：大鼠单侧 NAc shell注射狂犬病毒（RV）。7 d后，大鼠灌流取脑，冰冻切片后显微镜下观察神经元逆向示踪的表达。
　　结果：
　　实验一：首先，双因素方差分析发现 LY379268浓度（F(3,106)=3.485, p<0.05）和海洛因剂量（F(3,106)=3.045, p<0.05）存在统计学差异，但两者没有交互作用（p>0.05）。海洛因剂量为0.5 mg/injection/kg时LY379268对奖赏的抑制效应最明显，0.1和0.3 mg/kg LY379268组较对照组的注射针数均明显减少（p<0.05），1 mg/kg LY379268组较对照组极明显减少（p<0.01）。其次，单因素方差分析发现，PR程序下各组完成最后一针海洛因注射所需有效鼻触数（F(3,25)=3.492, p<0.05）和海洛因注射针数（F(3,25)=5.373, p<0.01）均有统计学差异。与对照组相比，1 mg/kg LY379268组完成最后一针的有效鼻触数和注射针数均明显减少（p<0.05和p<0.01）。最后，单因素方差分析发现，各组有效鼻触数（F(3,27)=4.084, p<0.05）和海洛因注射针数（F(3,27)=4.203, p<0.05）均有统计学差异。与对照组相比， LY379268组的有效鼻触数和注射针数均明显减少（p<0.05）；与LY379268组相比，LY341495+ LY379268组的有效鼻触数和注射针数均明显增加（p<0.05）。
　　实验二：首先，单因素方差分析发现 VTA各组有效鼻触数和注射针数均没有统计学差异（p>0.05）；NAc core各组有效鼻触数（F(2,15)=8.26, p<0.05）和注射针数（F(2,15)=6.16, p<0.05）均具有统计学差异，1 mg/kg LY379268组的有效鼻触数和注射针数较对照组均明显减少（p<0.05）；NAc shell各组有效鼻触数（F(2,16)=12.14, p<0.01）和注射针数（F(2,16)=11.70, p<0.01）均具有统计学差异，与对照组相比，0.3 mg/kg LY379268组的有效鼻触数和注射针数均明显减少（p<0.05），1 mg/kg LY379268组的有效鼻触数和注射针数均极明显的减少（p<0.01）。其次，单因素方差分析发现各组有效鼻触数（F(2,15)=6.25, p<0.05）和注射针数（F(2,15)=5.19, p<0.05）均有统计学差异。vmPFc-NAc shell组的有效鼻触数和注射针数较对照组均明显减少（p<0.05）。最后，独立样本 T检验发现，与对照组相比， BLA-NAc shell组的有效鼻触数和注射针数均没有明显差异（p>0.05）。
　　实验三：首先，单因素方差分析表明 FR1程序下 vmPFc各组的有效鼻触数（F(2,15)=5.14, p<0.05）、无效鼻触数（F(2,15)=5.32, p<0.05）和注射针数（F(2,15)=5.18, p<0.05）均有统计学差异。与对照组相比，vmPFc激活组的有效鼻触数和注射针数明显减少（p<0.05），无效鼻触数明显增加（p<0.05）；与NC组相比， vmPFc激活组的有效鼻触数呈减少趋势（p=0.063）。其次，单因素方差分析表明，FR1程序下BLA各组有效鼻触数接近统计学差异（p=0.058），而注射针数没有统计学差异（p>0.05）。与 NC组相比，BLA激活组的有效鼻触数有减少趋势（p=0.053）。最后，单因素方差分析表明，PR程序下BLA各组完成最后一针的有效鼻触数和注射针数均没有统计学差异（p>0.05）。BLA激活组光刺激时 NAc shell末梢记录到明显的神经元放电。
　　实验四：显微镜下观察到 vmPFc和 BLA均有神经元胞体或轴突投射到 NAc shell，且表达位置与核团注射LY379268或光遗传病毒的位点一致。
　　结论：
　　LY379268能明显降低海洛因成瘾大鼠的奖赏效应和给药动机，且主要的中枢位点位于NAc shell；进一步实验发现从vmPFc到NAc shell的mGluR2/3激活参与了对海洛因奖赏和动机的抑制作用。光遗传学研究发现刺激vmPFc谷氨酸能神经元减少大鼠有效鼻触的同时增加了无效鼻触，可能是vmPFc到NAc shell谷氨酸能投射的激活干扰了大鼠奖赏记忆的提取；激活BLA到NAc shell的mGluR2/3和谷氨酸能投射对海洛因成瘾大鼠的奖赏和动机均没有影响。

目录

声明

引言

1材料与方法

1.1实验动物

1.2实验药品和试剂

1.3主要仪器设备及耗材

1.4溶液配比

1.5实验方法

2实验设计

2.1实验一 腹腔注射LY379268对大鼠海洛因自身给药的影响

2.2实验二 脑核团微注射LY379268对大鼠海洛因自身给药的影响

2.3实验三 光刺激谷氨酸能神经元对大鼠海洛因自身给药的影响

2.4实验四 RV病毒逆向示踪验证到NAc shell的神经元核团投射

3实验结果

3.1海洛因自身给药大鼠模型的建立

3.2腹腔注射LY379268对大鼠海洛因自身给药的影响

3.3脑核团微注射LY379268对大鼠海洛因自身给药的影响

3.4光刺激谷氨酸能神经元对大鼠海洛因自身给药的影响

3.5 RV病毒逆向示踪验证到NAc shell的神经元核团投射

4讨论

5结论

参考文献

附录A 缩略词及中英文对照表

在学研究成果

致谢

附录B 文献综述:Akt在药物成瘾机制中的研究进展